הכנת מצע מיקרו-דפוס לחקר פנוטיפים של תאי Schwann

תקציר

מקור: Xu, Z., Orkwis, et al. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluat Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מתאר את הכנת המצע בתבנית מיקרו לחקר מפרט הפנוטיפ של התא. חותמת PDMS מצופה חלבון משמשת להעברת המיקרו-תבנית על גבי מכסה מצופה PDMS. לאחר מכן מטפלים בכיסוי עם חומר פעילי שטח כדי לעכב את הידבקות התאים במשטחים הלא רצויים. לאחר מכן מוסיפים תאים כדי להתיישב בתבנית ומודגרים לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. הכנת ואפיון מצע תרבית תאים

1. הכנת המצע
   1. ערבבו במרץ את אלסטומר הבסיס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ואת חומרי הריפוי באמצעות קצה פיפטה ביחס שבין 10:1 ל-60:1 עד לקבלת פיזור הומוגני של הבועות בתוך התערובת. הסר בועות באמצעות ייבוש ואקום עד לפיזור הבועות.
      הערה: במהלך פילמור PDMS, חומר הריפוי מוצלב עם אלסטומר הבסיס כדי לספק את התכונות המכניות הרצויות של הפולימר הסופי. ניתן לכוונן את יחסי ההצלבה כדי לשנות את קשיחות PDMS.
   2. הניחו טיפה (~0.2 מ"ל) של תערובת PDMS מיובשת על מכסה ריבועי או עגול (לדוגמה, 22 מ"מ x 22 מ"מ) וסובבו את החלקת הכיסוי על ציפוי מסתובב במהירות 2500 סל"ד למשך 30 שניות.
   3. יש לדגור על המכסה בתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 1-2 שעות, או בטמפרטורת החדר למשך הלילה, כדי שה-PDMS יתמצק.
   4. טפל בכיסוי באמצעות חומר ניקוי UV-אוזון למשך 7 דקות (אורך גל UV: 185 ננומטר ו -254 ננומטר) כדי להגביר את הידרופיליות פני השטח. מניחים אותו בצלחת מעוקרת של 6 בארות.
   5. לפני השימוש בו לתרבית תאים, לדגור על מצעים באתנול 70% למשך 30 דקות לפחות.
      זהירות: מנקה UV-אוזון יכול לייצר אוזון שמזיק לבני אדם. עבודה במכסה אדים כימי או עם צורה כלשהי של אוורור.
2. הכנת מצע מיקרו
   1. צייר את הגיאומטריה הרצויה ואת אזורי דבק התאים הרצויים (900 מיקרומטר², 1,600 מיקרומטר² ו- 2,500 מיקרומטר²) באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). צור מסיכת צילום כרום המבוססת על דפוסים אלה מספק מסחרי.
   2. בחדר נקי או בסביבה נטולת אבק, השתמש בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר פרוסות סיליקון. פרמטרים קריטיים עבור יישום מסוים זה הם כדלקמן: Photoresist: SU-8 2010; פרופיל ספין לפיזור הפוטו-התנגדות: 500 סל"ד ל-10 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה, ואז 3500 סל"ד ל-30 שניות עם תאוצה של 300 סל"ד לשנייה; אנרגיית חשיפה של אור UV: 130 mJ/cm2.
      הערה: גובה התבניות על פרוסות הסיליקון הוא כ-10 מיקרומטר בעקבות פרמטרים אלה. סדקים פוטנציאליים סביב הקצה מחוץ לתבניות המלבניות או המשולשות ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ אור לאחר שלב 1.2.2. אפיית רקיק הסיליקון ב 190 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מסייעת לחסל את הסדקים.
   3. הניחו את פרוסת הסיליקון בדוגמת בתוך צלחת פטרי עגולה בקוטר 150 מ"מ x גובה 15 מ"מ ושפכו PDMS נטול גזים (יחס ערבוב 10:1) כפי שהוכן בשלב 1.1.1 על פרוסת הסיליקון.
      הערה: ודא שעובי PDMS הוא לפחות 5 מ"מ כדי להקל על הטיפול במהלך שלבי הדפסת מיקרו-מגע.
   4. יש למצק PDMS על פרוסת סיליקון בתנור בטמפרטורה של 60°C למשך הלילה. אפשר ל-PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. חותכים במדויק חותמות מרובעות בגודל 30 מ"מ x 30 מ"מ המכילות את הדפוסים הנכונים מפרוסת הסיליקון באמצעות אזמל כירורגי. אין לפגוע בפרוסת הסיליקון.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפלים מסיליקון פעמים רבות בשלב זה כדי לייצר יותר בולים לאחר ניקוי עם איזופרופנול.
   5. יש לעקר את חותמות PDMS ואת הכיסויים המתכווננים (שהוכנו בשלבים 1.1.1 עד 1.1.3) על ידי טבילתם באתנול 70% למשך 30 דקות.
   6. כדי לאשר את היעילות של מיקרו-תבנית על ידי חותמות PDMS לאחר הדפסת מיקרו-מגע, יבש את פני השטח של חותמות PDMS באמצעות זרם אוויר מסונן ותמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) פיפטה 50 מיקרוגרם/מ"ל (Texas Red conjugated) כדי לכסות את כל הצד המעוצב של חותמת PDMS.
   7. דגרו חותמות PDMS עם תמיסת BSA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיחת חלבונים.
   8. יבשו את פני השטח של החלקות הכיסוי באמצעות זרם אוויר מסונן והגבירו את הידרופיליות פני השטח כמתואר בשלב 1.1.5.
   9. יבש באוויר את חותמות PDMS כדי להסיר את תמיסת BSA הנותרת.
      הערה: ודא שתמיסת BSA תוסר לחלוטין מהחותמת מכיוון שכל פתרון שנותר יגרום לחותמות להחליק על הכיסוי במהלך הדפסת מיקרו-מגע.
   10. הביאו את הצד המעוצב של הבול למגע קונפורמי עם הכיסוי המתכוונן לספיחת BSA על משטח הכיסוי. לחץ בעדינות על החותמת כנגד הכיסוי למשך 5 דקות.
       הערה: אין להפעיל כוח מופרז על הבול מכיוון שהוא יתכופף ויגרום למגע לא ספציפי בין הבול לתלוש הכיסוי. כמות הכוח המתאימה המופעלת על הבול חיונית להדפסת מיקרו-מגע מוצלחת.
   11. בחן את המיקרו-תבנית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC (Fluorescein isothiocyanate).
   12. כדי להדפיס אזורים של הדבקת תאים במקום תבניות פלואורסצנטיות, החלף את הלמינין בחלבון BSA וחזור על שלבים 1.2.5 עד 1.2.10.
   13. הסר חותמות מכיסויים והעבר את הכיסויים לצלחת מעוקרת בת 6 בארות. הוסף 2 מ"ל של 0.2% w/v תמיסת F-127 פלורונית לכל באר כדי לכסות את פני השטח של הכיסוי ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
       הערה: ניתן לספוג F-127 פלורוני על פני השטח של PDMS, מה שמגביר את ההידרופוביות של משטח PDMS כדי לחסום תאים מפני הידבקות.
   14. שאפו תמיסת F-127 פלורונית ושטפו 5x עם מלח חיץ פוספט (PBS) ופי 1 עם מדיום תרבית התאים לפני זריעת תאים. צפיפות זריעה טיפוסית עבור SCs היא 1,000 תאים לסמ"ק².
   15. 45 דקות לאחר זריעת תאים, הסירו את מדיום תרבית התאים ושטפו את הכיסויים עם PBS 2x כדי למנוע ממספר SCs להידבק לאותה תבנית. לשמור על תאים בסביבת תרבית התאים הרצויה במשך 48 שעות לפני הכימות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין מסרום בקר (BSA), טקסס אדום מצומד	תרמו פישר סיינטיפיק	A23017	צביעת BSA כדי להראות micropatterns
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	תרמו פישר סיינטיפיק	11965092	מדיום תרבית תאים
סרום בקר עוברי	תרמו פישר סיינטיפיק	16000044	תרבית תאים בינונית משלימה
פיברונקטין	תרמו פישר סיינטיפיק	33010-018	חלבון המשמש לציפוי כיסויים
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	ליקוי חמה Ti2	מיקרוסקופ פלואורסצנטי
למינין	תרמו פישר סיינטיפיק	23017015	חלבון המשמש לציפוי כיסויים
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	תרבית תאים בינונית משלימה
F-127 פלורוני	סיגמא אולדריץ'	P-2443	חסום קשירת חלבון לא ספציפית
SYLGARD 184 PDMS בסיס וסוכן ריפוי	סיגמא אולדריץ'	761036	פולימר מתכוונן המשמש לציפוי כיסויים
מנקה UV-אוזון	נובאסקאן		הגדל את ההידרופיליות של PDMS