בידוד תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של העכבר

תקציר

מקור: He, Q., et al., &; Ding, F. טיהור פיברובלסטים ותאי שוואן מעצבים סנסוריים ומוטוריים במבחנה. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר את הבידוד והטיפוח של תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של עכבר. תאים מבודדים עוברים תרבית במדיה ספציפית. תאי Schwann מבודדים באמצעות עיכול דיפרנציאלי והיצמדות. לאחר מכן הם מועברים לכיסויים חוץ-תאיים מצופים מטריצה לצורך התקשרות והתפשטות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד ותרבית של פיברובלסטים עצביים מוטוריים ותחושתיים ו-SC (תאי Schwann)

1. השתמשו בחולדות Sprague-Dawley (SD) בנות שבעה ימים (n=4) ממרכז החיות הניסיוני באוניברסיטת ננטונג בסין. הכניסו את החולדות למיכל המכיל 5% איזופלורן למשך 2-3 דקות, אפשרו לבעלי החיים לנשום לאט וללא פעילות עצמאית, ולאחר מכן חיטאו באמצעות 75% אתנול לפני עריפת הראש.
2. השתמש מספריים לחתוך את העור האחורי במשך כ 3 ס"מ ולהסיר את עמוד השדרה. פתח את תעלת החוליות בזהירות כדי לחשוף את חוט השדרה.
3. שמור על חוט השדרה בצלחת פטרי 60 מ"מ עם 2-3 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של D-Hanks (HBSS) קרה כקרח.
4. בהתבסס על המבנה האנטומי, הבלו את שורש הגחון (עצב מוטורי) ולאחר מכן את השורש הגבי (עצב תחושתי) תחת מיקרוסקופ ניתוח. לאחר מכן, הניחו אותם בתמיסת מלח מאוזנת של D-Hanks (HBSS) קרה כקרח.
5. לאחר הסרת HBSS, פורסים את העצבים לחתיכות 3-5 מ"מ עם מספריים ומעכלים עם 1 מ"ל של 0.25% (w/v) טריפסין ב 37 ° C במשך 18-20 דקות. לאחר מכן, להשלים עם 3-4 מ"ל של DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את העיכול.
6. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות כעשר פעמים וצנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהשעות את המשקע ב 2-3 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS.
7. סננו את תרחיף התא באמצעות מסנן 400 רשת, ולאחר מכן חסנו את התאים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ והתרבית בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO2. לאחר 4-5 ימים של תרבית, בודדו את המעבר 0 (p0) פיברובלסטים ו-SCs לאחר שהגיעו למפגש של 90%.
8. בידוד ותרבות של SCs (איור 1)
   1. שטפו את התאים פעם אחת באמצעות 1x PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% (w/v) טריפסין (37 ° C) לכל צלחת פטרי 60 מ"מ כדי לעכל את התאים במשך 8-10 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, 3 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS נוסף כדי לעצור את העיכול.
   2. נושפים בעדינות את התערובת עם פיפטה כדי לנתק את SCs. לאחר מכן, לאסוף ולצנטריפוץ את SCs ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
   3. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות את השאריות ב-3 מ"ל DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מיקרומטר פורסקולין ו-10 ננוגרם/מ"ל HRG, ולאחר מכן לחסן את התאים בצלחת פטרי 60 מ"מ לא מצופה. לאחר תרבית בטמפרטורה של 37°C במשך 30-45 דקות, הפיברובלסטים (כמה פיברובלסטים מתעכלים עם SCs) נצמדים לתחתית המנה.
   4. מעבירים את הסופרנאטנט (כולל ה-SCs) לפולי-ל-ליזין אחר (PLL) - צלחת בינונית מצופה ותרבית בטמפרטורה של 37°C למשך יומיים.

תוצאות

איור 1: התרשים הסכמטי המציג את שלבי ההפרדה והטיהור של פיברובלסטים סנסוריים ומוטוריים ו- SCs.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת המלח המאוזנת של D-Hank	גיבקו	14170112
DMEM	קורנינג	10-013-CV
מיקרוסקופ מנתח	אולימפוס	SZ2-ILST
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו	10099-141ג
פורסקולין	סיגמא	F6886-10MG
0.25% (עם V/V) טריפסין	גיבקו	25200-072
מנות תרבות
צינורות צנטריפוגות
כיסויים
פולי-ל-ליזין
אינקובטור CO2