$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת תרבית אנדותל עכבר בתוספות תמיכה חדירות
הערה: תאי BEND3 נשמרים בהתאם להוראות היצרן.
- הכן BEND3 תא בינוני (BM) על ידי הוספת 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין לתוך 500 מ"ל של DMEM ומערבבים היטב.
- שאפו את המדיום מהצלחת ושטפו את תרבית התאים BEND3 עם 1 מ"ל של PBS פעם אחת. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (אתילן דיאמין חומצה טטראצטית) לתאים ודגור אותם במשך 4 דקות ב 37 ° C.
- הוסף 1 מ"ל של BM לתאים כדי לנטרל טריפסין-EDTA ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק לחלוטין את התאים. העבר את מתלה התא לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל וגלולה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות ב 400 x גרם.
- שאפו את הסופרנאטנט מהצינור והשעו מחדש את התאים עם 9 מ"ל של BM טרי, ואז הוסיפו 1 מ"ל של תרחיף תאים לתוספת תמיכה חדירה אחת. הוסף עוד 2 מ"ל של BM טרי לכל באר בתא התחתון של המטריצה. המשיכו לגדל את התאים בתרבית במשך יום אחד.
2. הקמת תרבית משותפת עצבית-אנדותל ומערכת תיוג Ac4ManNAz
- יום אחד, לאחר ציפוי תאי BEND3 בתוספות, שאפו בעדינות את המדיום בחדר התחתון תחילה, ולאחר מכן את התוספות. שטפו את פני התוספות 3 פעמים עם DMEM שחומם מראש (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco). שטפו את המשטח החיצוני של התוספות על ידי שטיפה עם DMEM שחומם מראש.
- הוסף 1 מ"ל של AM שחומם מראש (תווך דבק) לתוך תוספת אחת, ולאחר מכן להעביר את התוספות לתוך בארות עם תאים קליפת המוח הראשוניים. לדגור על התרבות המשותפת ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 12 שעות.
- יש להמיס את Ac4ManNAz ב-DMSO (דימתיל סולפוקסיד) כדי להגיע לריכוז מלאי של 200 mM. 12 שעות לאחר הגדרת התרבית המשותפת של האנדותל העצבי, הוסף 1 μL של מלאי Ac4ManNAz לכל תא תחתון ו-0.5 μL של מלאי לכל הכנסה לתרבית המשותפת. נערו את הצלחות מיד ובעדינות כדי לערבב היטב את המדיום. עבור תאי הבקרה, הוסף נפח שווה של DMSO.
- תרבית את התאים במשך 5 ימים נוספים ב 37 ° C ו 5% CO2. הכינו את AM עם 10x bFGF כאמצעי הזנה מחדש (RM). במהלך תקופה זו, הוסף 100 μL של RM לכל תוספת ו 200 μL של RM לכל תא תחתון כדי להזין מחדש את תאי האנדותל ותאי העצב כל יומיים. במהלך ההזנה מחדש, אין לספק Ac4ManNAz או DMSO לתרבית.