הכנת צינורות אנדותל מוחיים מעורקים פרנכימליים של עכבר

תקציר

מקור: Hakim, M. A., et al., בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של פרנכימה במוח עכבר. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד צינורות האנדותל מפרנכימה מוחית של עכבר. באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית, התהליך מניב צינור שלם עם תאי אנדותל.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. פתרונות ותרופות

1. תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
   1. הכינו מינימום של 1 ליטר PSS באמצעות 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), וגלוקוז 10 mM.
   2. הכינו את הפתרונות הדרושים החסרים CaCl₂ (אפס Ca²⁺ PSS) לדיסקציה של עורקי המוח ולבידוד צינור אנדותל.
      הערה: הכינו את כל התמיסות ב-H2O נטול יונים, ולאחר מכן סינון (0.22 מיקרומטר). ודא כי המוצר הסופי מכיל pH 7.4 עם אוסמולליות בין 290 ל 300 mOsm.
2. אלבומין בסרום בקר (BSA, 10%)
   1. יש להמיס 1 גרם של אבקת BSA lyophilized בכוס של 10 מ"ל של אפס Ca^{2 +} PSS. כסו את הכד והמתינו לפחות שעתיים עם ערבוב איטי עד שה-BSA יתמוסס.
   2. סנן פתרון באמצעות מזרק 10 מ"ל בתוספת מסנן 0.22 מיקרומטר והכן 1 מ"ל aliquots לאחסון ב -20 ° C.
3. פתרון דיסקציה
   1. הוסף 500 μL של BSA (10%) ל- 49.5 מ"ל של אפס Ca²⁺ PSS לקבלת נפח כולל של 50 מ"ל.
   2. מעבירים את התמיסה לצלוחית פטרי לדיסקציות עורקים.
4. פתרון דיסוציאציה
   1. הוסף 5 μL של תמיסת CaCl₂ (1 M) ו- 500 μL של BSA (10%) ל- 49.5 מ"ל של אפס Ca²⁺ PSS לקבלת נפח כולל של 50 מ"ל. לדגור על התמיסה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה.
5. אנזימים
   1. הכן 1 מ"ל של תמיסת עיכול עם 100 מיקרוגרם / מ"ל פפאין, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל collagenase (תערובת סוג H), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל elastase.
      הערה: פעילות האנזימים יכולה להשתנות, אם כי פרוטוקולים מוצלחים ידרשו ככל הנראה את הפעילויות האנזימטיות הבאות: ≥ 10 יחידות / מ"ג עבור פפאין, ≥ יחידה אחת / מ"ג עבור collagenase, ו ≥ 5 יחידות / מ"ג עבור elastase.
       

2. בידוד של עורקים parenchymal

הערה: עורקים הנובעים מעורקי המוח האמצעיים (MCAs) ומוטבעים בפרנכימה במוח נבחרים עבור פרוטוקול זה. העורקים מבודדים כפי שתואר קודם לכן11, עם שינוי.

1. השתמשו בפינים מפלדה (קוטר: 0.2 מ"מ, אורך: 11 עד 12 מ"מ) כדי לאבטח את המוח המבודד בתמיסת דיסקציה קרה בצלוחית פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימר מושרה בפחם (עומק ≥ 50 ס"מ).
2. בעזרת מספריים חדים ומיושרים לדיסקציה, חתכו מלבן של רקמת המוח (אורך: 5 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ) (איור 1B) מסביב ל-MCA תוך הקפדה שהחלק העליון של מקטע הרקמה יעבור את נקודת ההסתעפות ממעגל וויליס. חתכו מלבן נוסף של רקמת המוח מההמיספרה השנייה של המוח כדי לגשת לעורקים נוספים במידת הצורך.
3. אבטחו את מקטע רקמת המוח המופרדת לתוך הצלחת כאשר ה-MCA פונה כלפי מעלה (דיסטלי ממעגל וויליס) באמצעות פיני פלדה (קוטר: 0.1 מ"מ, אורך: 13 עד 14 מ"מ). בצעו בזהירות חתך רדוד ליד הפינים כדי להסיר את הפייה בעזרת מלקחיים קטנים, וקילפו בעדינות מקצה אחד לכיוון השני (איור 1C). הסר את הפייה ממקטע הרקמה השני כדי לגשת לעורקים נוספים במידת הצורך. אבטחו בזהירות את הפייה המבודדת בעזרת עורקים פרנכימליים המסועפים מ-MCA בצלוחית עם הפינים, ונתחו את העורקים הפרנכימליים (איור 1D), כדי לוודא שהעורקים אינם ניזוקים.
   הערה: אם העורקים אינם נשלפים בקלות עם הפייה מהפרנכימה, השתמשו במלקחיים עדינים וחפרו לתוך המוח, החל מנקודת ההסתעפות MCA ממעגל וויליס. אתרו את העורק, שחררו בזהירות את הרקמה סביב העורקים (איור 1E), ומשכו בעדינות את העורק החוצה מהפרנכימה, כשהם מחזיקים את הקצה העליון של העורק (איור 1F). ניתן לבודד עורקים מרובים (אורך: ~ 1.5-2 מ"מ) ממלבן אחד של רקמת המוח.
4. ודאו שהעורק נקי ללא רקמה מחוברת אליו, וחתכו את כל הענפים הדיסטליים שנותרו (איור 2A). השתמש בעורק נקי ושלם זה לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל עורק לשני חלקים (אורך: 0.75-1 מ"מ) לעיכול אנזימטי להכנת צינורות אנדותל אם תרצה.
    

3. עיכול עורקים parenchymal והכנת צינורות אנדותל

1. סידור ציוד ופיפטות
   הערה: בידוד של צינורות אנדותל עורקיים מהמוח תואר בעבר13,18. הפרוטוקול הנוכחי משלב שינויים לבידוד אנדותל מעורקים פרנכימליים (תוך מוחיים). ניתן להשתמש במספר עורקים ו/או חתיכות עורקים יחד לעיכול אנזימטי.
   1. הרכיבו את מנגנון הטריטורציה13 להכנת צינורות אנדותל באמצעות שלב אלומיניום התומך בתא ובמיקרומניפולטורים. הרכיבו מיקרוסקופ המצויד במטרות (5x-60x) ומצלמה המחוברת לצג מחשב. אבטחו מיקרומזרק עם בקר משאבה ליד הבמה והדגימה.
   2. הצמידו פיפטת טריטורציה ממולאת בשמן מינרלי מעל הבוכנה המיקרו-מזרקית. השתמש במיקרומזרק עם בקר המשאבה כדי למשוך את תמיסת הדיסוציאציה לתוך פיפטת טריטורציה (~ 130 nL) על גבי השמן המינרלי תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר בפיפטה.
2. עיכול חלקי של קטעי עורקים
   1. הניחו מקטעי עורקים שלמים לתוך 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה בצינור זכוכית של 10 מ"ל המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל פפאין, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל collagenase, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז. לדגור על מקטעי עורקים ב 34 ° C במשך 10-12 דקות.
   2. לאחר העיכול, להחליף את הפתרון האנזים עם 3-4 מ"ל של פתרון דיסוציאציה טרי בטמפרטורת החדר.
3. בידוד של צינור אנדותל עורקי
   הערה: לאחר העיכול והחלפת תמיסת האנזים, העבירו מקטע אחד או יותר מעוכלים חלקית לתמיסת הדיסוציאציה בתא עירוי-על המחובר לפלטפורמה ניידת. בעת צפייה בהגדלה של פי 100 עד פי 200, בחר קטע כלי אחד מעוכל חלקית אך בלתי שבור והתמקד בו תחת המיקרוסקופ.
   1. מניחים את פיפטת הטיריטורציה המחוברת למזרק המיקרומזרק בתמיסת הדיסוציאציה בתא וממקמים אותה קרוב לקצה אחד של קטע כלי הדם המעוכל. הגדר קצב בטווח של 1-3 nL/s בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.
   2. תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, משכו את מקטע העורקים לתוך פיפטה ואז הוציאו כדי לנתק את תאי השריר האדוונטיה והחלקה (איור 1B). טריטורציה של מקטע כלי הדם עד שכל תאי השריר החלק מנותקים, ורק תאי אנדותל נשארים כ"צינור" שלם.
      הערה: במידת הצורך במהלך הטריטורציה, השתמש בזהירות במלקחיים עדינים כדי להסיר את האדוונטציה המנותקת ואת הלמינה האלסטית הפנימית מצינור האנדותל. בדרך כלל, רק כמה מחזורים של טריטורציה מניבים צינור אנדותל שלם.
   3. השתמשו במיקרומניפולטורים כדי לאבטח כל קצה של צינור האנדותל על מכסה הזכוכית בתא באמצעות פיפטות הצמדת זכוכית בורוסיליקט (איור 2C,D).
4. אבטחת צינור האנדותל העורקי
   1. החלף את תמיסת הדיסוציאציה בתמיסת עירוי (PSS המכילה 2 mM CaCl₂) תוך הקפדה על שטיפת חומר שאינו אנדותל אל מחוץ לתא.
   2. העבר את צינור האנדותל המאובטח בפלטפורמה הניידת למתקן המיקרוסקופ המיועד לעירוי רציף ולהקלטות/הדמיה תוך-תאיות או פלואורסצנטיות.
   3. החל אספקה רציפה של PSS במהלך הניסוי. הגדר ידנית את קצב הזרימה (5-7 מ"ל/דקה) לאורך כל הניסוי באמצעות שסתום בקרת זרימה מוטבע, התואם את הזרימה הלמינרית, תוך התאמת הזנת זרימת התמיסה למידת שאיבת הוואקום. יש לאפשר זרימת PSS של ≥5 דקות לתא לצורך עירוי של צינור האנדותל לפני קבלת נתוני רקע ו/או העמסת צבע.

תוצאות

איור 1: דיסקציה ובידוד של עורקים פרנכימליים. (A) מוח עכבר מבודד עם מעגל שלם של וויליס. (B) חתיכה מלבנית מנותחת של רקמת מוח המכילה את ה-MCA (חץ לבן). (C) בידוד של pia מהחלק העליון של הרקמה (עורק, חץ כחול). (D) עורקים (מסומנים בראשי חץ כחולים) המחוברים לעורקי המוח האמצעיים (חיצים צהובים). (E) עורק מזוהה (חץ כחול) ברקמת המוח. (F) משיכת העורק (חץ כחול) מהרקמה המשוחררת. שימו לב שלוחות E ו-F מציינים שיטה ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מקרר אמבט (Isotemp 500LCU)	תרמופישר סיינטיפיק	13874647
נימי זכוכית בורוסיליקט (הצמדה)	וורנר אינסטרומנטס	G150T-6
נימי זכוכית בורוסיליקט (אלקטרודות חדות)	וורנר אינסטרומנטס	GC100F-10
נימי זכוכית בורוסיליקט (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	1B100-4
BSA: אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A7906
CaCl2: סידן כלורי	סיגמא	223506
Collagenase (תערובת סוג H)	סיגמא	C8051
דיגיטציה של רכישת נתונים	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	Digidata 1550A
צלחת דיסקציה (פטרי זכוכית עם תחתית סילגארד פחם)	מכשור מערכות חיות, סנט אלבנס סיטי, VT, ארה"ב (ארצות הברית)	DD-90-S-BLK
דיתיואריתריטול	סיגמא	D8255
DMSO: דימתיל סולפוקסיד	סיגמא	D8418
אלסטאז (לבלב חזירי)	סיגמא	E7885
שסתום בקרת זרימה	וורנר אינסטרומנטס	FR-50
ממשק מערכת פלואורסצנטית, מנורת ARC וספק כוח, היפרסוויץ' ו-PMT	התקנים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	מערכות IonOptix
מלקחיים (עדינים, מחודדים)	FST	דומונט #5 ודומונט #55
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)	G7021
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	סיגמא	H4034
KCl: אשלגן כלורי	סיגמא	עמ' 9541
MgCl2: מגנזיום כלורי	סיגמא	M2670
מיקרומניפולטור	סיסקיו	MX10
מושך מיקרופיפטה (דיגיטלי)	סאטר אינסטרומנטס, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	P-97 או P-1000
מיקרוסקופ (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, מלוויל, ניו יורק, ארה"ב (ארצות הברית)	צ2
מיקרוסקופ (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	ליקוי חמה TS100
שלב המיקרוסקופ (אלומיניום)	Siskiyou, Grants Pass, OR, ארה"ב (ארצות הברית)	8090P
בקר משאבת מיקרומזרק	World Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)	SYS-MICRO4
NaCl: נתרן כלורי	סיגמא	S7653
פפאין	סיגמא	עמ' 4762
מטרות ניגודיות פאזות	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X ו-20X)
מספריים (להבים 3 מ"מ ו-7 מ"מ)	Fine Science Tools (או FST), פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב	מוריה MC52 &; 15000-00
מספריים (בסגנון Vannas; להבים 9.5 מ"מ ו-3 מ"מ)	מכשירים מדויקים בעולם	555640S, 14364
בקר טמפרטורה (ערוץ כפול)	וורנר אינסטרומנטס	TC-344B או C
מערכת בקרת שסתומים	וורנר אינסטרומנטס	VC-6