כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. דיסקציה של דיסק בין-חולייתי של בקר
- שטפו היטב את כל הזנב במי ברז כדי להסיר לכלוך ושיער על פני השטח.
הערה: עם קצוות שלמים ודיסטליים, ניתן להשתמש לכל היותר ב-9 דיסקים בין-חולייתיים (IVDs) (עצם הזנב 1-9) לכל זנב, בהתאם לגודל הרצוי של ה-IVDs. בהתחשב בקוטר הרצוי בין 15-20 מ"מ, השתמשנו ב-12 זנבות בקר עם 5 IVD לכל זנב לצורך הניסויים.
- טבלו את כל הזנב בקופסה המכילה תמיסת בטאדין 1% למשך 10 דקות. יבשו לזמן קצר את הזנב בגזה סטרילית והניחו אותו על דראפ סטרילי.
הערה: במהלך דיסקציה של הדיסק, לחות את הזנבות עם פתרון של רינגר גזה רטובה כדי למנוע התייבשות. אחסנו את הזנבות (או הפלחים שנותרו) עטופים בגזה רטובה עד להשלמת הליך הדיסקציה כולו.
- השתמש באזמל (מס '20) כדי להסיר את הרקמה הרכה באופן מלא ככל האפשר מעמוד השדרה הקאודלי כדי להקל על זיהוי ה- IVDs. הסר את התהליכים השדרתיים הרוחביים של החוליות עם צבת להסרת עצם.
הערה: בחר IVDs עם הקוטר הרצוי. IVDs עם טווח קוטר של 15-20 מ"מ שימשו במחקר הנוכחי.
- חתכו לרוחב עם צבת עצם דרך אמצע כל גוף חוליה כדי לקבל קטעי תנועה בודדים. שים קטעי תנועה בצלחת פטרי עם גזה רטובה עם הפתרון של רינגר.
- אתר את ה- IVD והחוליה על ידי מישוש ועל ידי הזזת קטעי התנועה בעדינות. בצע שני חתכים מקבילים עם מסור הרצועה בלוח הצמיחה של IVDs, אחד בכל צד של IVD. זהה את מיקום לוחית הגידול על ידי נגיעה ומציאת האתר הקמור של החלק הגרמי (קשה) הסמוך לדיסק (רך) עם מרחק בטיחות של כ 0.5-1 מ"מ מה- IVD לכיוון החוליה. ודא כי להב מסור הרצועה מקורר באמצעות תמיסה של רינגר בעת חיתוך החוליות.
- מעבירים IVD בצלחת פטרי נקייה עם גזה נקייה שנרטבה בתמיסת רינגר.
הערה: הגזה צריכה להיות רטובה ולא רטובה מדי כדי למנוע נפיחות של IVDs,
- השתמש בלהב האזמל כדי לגרד את גוף החוליה (עצם אדומה/ורודה), לוחית צמיחה (סחוס לבן), השאר את לוחית הקצה שלמה (צהוב-ורוד). הפוך את שני המשטחים שטוחים ומקבילים להליך ההעמסה. מעבירים עירויים גרוסים לצלחת פטרי טרייה עם גזה רטובה בתמיסה של רינגר.
הערה: לבשו כפפת שרשרת כדי להגן על היד בזמן שאתם אוחזים ב-IVD ומגרדים.
- מדוד את גובה וקוטר הדיסק באמצעות קליפר. נקו את קרישי הדם בעצם החוליות בעזרת תמיסת רינגר באמצעות מערכת שטיפת סילון.
- העבר את ה- IVD לצינורות פלסטיק של 50 מ"ל, IVD אחד לכל צינור. הוסף 25 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) + 10% פניצילין/סטרפטומיצין (P / S) לכל IVD ולהשאיר אותו רועד במשך 15 דקות על שייקר מסלול בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 10 מ"ל PBS + 1% P/S לכל IVD למשך 2 דקות כדי לשטוף את העירוי.
2. תרבות IVD וטעינה
- העברת דיסקים לתאי IVD והוספת מדיום תרבית IVD (מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM, 4.5 גרם / ליטר DMEM גלוקוז גבוה לקבוצה הפיזיולוגית ו- 2 גרם / ליטר DMEM גלוקוז נמוך לקבוצה הפתולוגית) + 1% P / S + 2% סרום עגל עובר + 1% ITS (מכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 6 מיקרוגרם / מ"ל טרנספרין, ו 5 ng / mL חומצה סלנית) + 50 מיקרוגרם / מ"ל ascorbate-2-פוספט + 1% חומצת אמינו לא חיונית + 50 מיקרוגרם / מ"ל סוכן מיקרוביאלי עבור תאים ראשוניים) ומניחים באינקובטור ב 37 ° C, 85% לחות ו 5% CO2.
- תרבית את הדיסקים במשך 4 ימים בתוך מערכת ביוריאקטור על פי קבוצות ניסוי. בקבוצה הפתולוגית, לשמור על תנאי עומס ניווניים ב 0.32-0.5 MPa, 5 הרץ במשך 2 שעות / יום. בקבוצת הביקורת הפיזיולוגית, השתמש בפרוטוקול טעינה של 0.02-0.2 MPa, 0.2 הרץ למשך שעתיים ביום.
הערה: מקם את ה- IVD בתאים המכילים 5 מ"ל של תווך IVD במהלך הליכי ההעמסה. הנפח תלוי בגודל תאי ההעמסה של הביוריאקטור. בין הליכי ההעמסה, הניחו את ה- IVD בצלחות שש בארות עם 7 מ"ל של מדיום תרבית IVD להתאוששות מנפיחות חופשית.
- לניתוח השינויים בגובה הדיסק במהלך תקופת הניסוי, יש למדוד את גובה הדיסק באמצעות קליפר לאחר דיסקציה IVD (קו בסיס) ולאחר מכן מדי יום לאחר תקופת הנפיחות החופשית ולאחר העמסה דינמית למשך הניסוי.
