התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

Abstract

מקור: Assetta, B., et al., <a href="https://app.jove.com/v/61778">דור של נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתמיין לנוירונים על ידי העברתם עם לנטי-וירוסים מהונדסים הנושאים גן גורם שעתוק נוירוגני תחת שליטה של אלמנט מגיב טטרציקלין, ולאחר מכן טיפול בנגזרת טטרציקלין ומדיום התבגרות.

Protocol

1. השראת נוירונים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

1. הכנת Lentivirus (~ 5 ימים, פרוטוקול מפורט כפי שתואר קודם לכן)
   1. צלחת ~ 1 מיליון HEK293T תאים בכל בקבוק T75 כדי לקבל אותם ~ 40% confluent בעת ביצוע transfection. הדביקו אותם עם פלסמידים המבטאים Ngn2 המושרה טטרציקלין וגן עמיד לפורומיצין (PuroR; תחת אותה בקרת מקדם TetO), rtTA, ושלושת הפלסמידים המסייעים pRSV-REV, pMDLg/pRRE ו-VSV-G (12 מיקרוגרם של DNA וקטורי לנטיוויראלי ו-6 מיקרוגרם של כל אחד מהדנ"א של פלסמיד המסייע). הכינו לפחות שלוש צלוחיות לכל הכנת לנטיוירוס. השתמש ב- PEI להעברה בהתאם להוראות היצרן. שנה את המדיה לאחר 16 שעות ובטל.
   2. Harvest שחררה חלקיקים ויראליים על ידי איסוף מדיה תרבותית מדי יום והחליפה במדיה טרייה במשך 3 ימים. אגרו את המדיה שנאספה המכילה חלקיקים נגיפיים לטיהור. סנן את הנגיף דרך מסנן 0.22 מיקרומטר וצנטריפוגה במהירות 49,000 x גרם למשך 90 דקות. השהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של PBS-גלוקוז (~ 150 μL).
2. אינדוקציה של נוירונים (~ 5 ימים)
   הערה: פרוטוקול אינדוקציה זה (איור 1A; דיאגרמת זרימה) יעיל מאוד הן עבור תאי iPS והן עבור תאי ES בעלי פלוריפוטנציה מאומתת (אשר ניתן לבדוק על-ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של סמני פלוריפוטנציה מאופיינים היטב; איור 1B).
   1. השתמש בתאי H1 אנושיים ES הזמינים באופן מסחרי במעבר של 52 (ראה טבלת חומרים). תרבית את התאים על לוחות 6 בארות מצופות בתמיסת מטריצה חוץ-תאית (~0.5 מ"ג של תמיסת מטריצה לכל צלחת של 6 בארות; ראה טבלת חומרים) באמצעות מדיום תחזוקת תאי ES (ראה טבלת חומרים) ודגרה על הלוחות ב -37 ° C עם 5% CO₂.
   2. ביום -2, יש לנתק תאי ES (80% במפגש) עם 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מעבירים את התאים לצינור; שוטפים את הבאר עם 2 מ"ל מדיה ומשלבים באותו צינור. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשהות מחדש את הגלולה במדיה, ואת צלחת התאים על לוחות מצופים מטריצה 6 בארות בצפיפות זריעה של 1 x 10₅ תאים לכל באר.
   3. ביום -1, הוסיפו לנטי-וירוסים המבטאים Ngn2 בתוספת PuroR ו-rtTA יחד עם פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) לתאי ES באמצעי תחזוקה טריים של תאי ES (ראו טבלת חומרים). הכמות המדויקת של וירוסים צריכה להיקבע על ידי טיטרים בפועל או הטיטרציה. בדרך כלל אנו מוסיפים 5 μL כל וירוס לכל באר בצלחת של 6 בארות.
   4. ביום 0, הוסף דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם/מ"ל להפעלת ביטוי Ngn2) בתווך DMEM-F12 עם תוסף N2 ללא מורפוגנים.
   5. ביום הראשון, הוסף פורומיצין בתווך טרי של DMEM-F12 בתוספת N2 ודוקסיציקלין, לריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל בינוני. בחר את התאים המומרים בפורומיצין למשך 24 שעות לפחות. ייתכן שיידרשו ריכוז פורומיצין גבוה יותר (עד 5 מק"ג/מ"ל) ותקופת בחירה ארוכה יותר (עד 48 שעות) כדי להסיר כראוי את התאים שעברו תת-התמרות אם טיטר הנגיף נמוך.
   6. ביום השני, נתקו תאי עצב מתמיינים באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים), ציפו אותם מחדש על לוחות של 24 בארות (בין 80,000 ל-200,000 תאים/באר) המצופים בתמיסת מטריצה (ראו טבלת חומרים), ותשמרו אותם בתווך NBA/B27 ללא דוקסיציקלין. צפיפות הזריעה היא קריטית.
   7. בשלב זה, נוירונים מנותקים יכולים להיות מוקפאים בתווך הקפאה מסחרי מיוחד (ראה טבלת חומרים) ומאוחסנים בחנקן נוזלי למשך עד 3 חודשים. תאי עצב טהורים יכולים להיות מצופים ומהווים את ~15%-20% מוות תאי לאחר ההפשרה, בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם סוגי תאי מוח אחרים.
   8. תרבית iNs טהורה על הצלחות מצופות בתמיסות חוץ-תאיות מבוססות מטריצה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). המורפולוגיה הפירמידלית האופיינית צריכה להיות ברורה עד יום 4 (ויום 6; איור 1C). היווצרות הסינפסה יכולה להיות מזוהה כבר ביום 14 עד 16 והיא בולטת ביום 24 על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית עם סמנים סטנדרטיים לפני ואחרי סינפטיים. (איור 1D; מסומן עם הסמן הקדם-סינפטי Synapsin 1 והסמן הדנדריטי Map2).

Results

איור 1: יצירה ישירה של תאי עצב המושרים על-ידי בני אדם (iNs) מתאי עצב בעלי תאי גזע בעלי תאי גזע עוברי hPSC. (A) דיאגרמת זרימה של יצירת iN. (B) תמונות מייצגות של שדה בהיר ואימונופלואורסנציה של התרבית ההתחלתית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (H1) כדי לאשר את הפלוריפוטנציה. Oct4 מוצג באדום ו-Sox2 בירוק. (C) תמונות שדה בהירות מייצגות של iNs ביום 4 ובי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אקוטאזה	טכנולוגיות STEMCELL	7920
תוסף B27	תרמופישר	17504044
DMEM/F12 בינוני	טכנולוגיות STEMCELL	36254
DMSO	תרמופישר	D12345
דוקסיציקלין	MilliporeSigma	D3072
תאי ES אנושיים H1	ויסל	WA01
מטריג'ל	קורנינג	354234
mTeSR פלוס	טכנולוגיות STEMCELL	5825
תוספת N2	תרמופישר	17502001
נוירובזל מדיום A	תרמופישר	10888-022
חומצות אמינו לא חיוניות	תרמופישר	11140-050
פיי	VWR	71002-812
pMDLg/pRRE	אדג'ין	12251
פוליברן	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	אדג'ין	12253
פורומיצין	תרמופישר	A1113803
STEMdiff Neural Progenitor הקפאת מדיה	טכנולוגיות STEMCELL	5838
ערכת השראה עצבית STEMdiff SMADi	טכנולוגיות STEMCELL	8581
Tempo-iOlogo: רכיבי OPC אנושיים שמקורם ב-iPSC	טמפו ביוסיינס	מק"ט102
טטו-נג2-פורו	אדג'ין	52047
VSV-G	אדג'ין	12259