התמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לאוכלוסיית נוירונים מרושתת

Abstract

מקור: Hubbard, K. et al., הערכה תפקודית של נוירוטוקסינים ביולוגיים בתרביות מרושתות של נוירונים במערכת העצבים המרכזית שמקורם בתאי גזע.J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים טכניקה להתמיינות תאי גזע עובריים לאוכלוסייה מרושתת של נוירונים עם סינפסות מתפקדות. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהתמיינות תאי גזע עובריים לנוירונים, השראת היווצרות רשת עצבית והעשרת התרבית עם נוירונים מרושתים.

Protocol

1. דיפרנציאציה עצבית

הערה: בצע שלבים 1.1 - 1.5 לפני הצהריים ושלב 1.7 אחרי הצהריים. סקירה כללית של הליכי הבידול מוצגת באיור 1A.

1. מעבירים 350 μl (3.5 x 10⁶) של תאי גזע עובריים לצלחת בעלת חיבור נמוך בקוטר 10 ס"מ המכילה מדיום בידול בנפח 25 מ"ל. מניחים על שייקר מסלול מוגדר 30 - 45 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות ב 37 ° C עם 5% CO₂. זהו היום הראשון של ההבחנה, המכונה יום במבחנה (DIV) -8.
   הערה: השימוש בצלחת חיבור נמוכה במיוחד מייקר את עלות השיטה אך מניב יבולים מעט גדולים יותר מצלחות פטרי חיידקיות מכיוון שאגרגטים יכולים להיצמד מדי פעם לצלחות פטרי. אם מעדיפים גדלים שונים של מנות, ניתן לשנות את קנה המידה של נפחים בינוניים ומספרי תאים בהתאם.
2. לאחר 48 שעות (DIV -6), השתמש בפיפט של 25 מ"ל כדי להעביר את צברי התאים המתמיינים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מיד להוסיף 25 מ"ל טרי של מדיום בידול צלחת פטרי.
3. אפשר לאגרגטים לשקוע במשך 2 - 5 דקות, ולייצר גלולה גלויה בעומק 1 - 2 מ"מ. התעלם מתאים בודדים או מצברים קטנים שנותרו בהשעיה. שאפו בזהירות את התווך והעבירו את גלולת התא חזרה לצלחת הפטרי באמצעות P1000. מניחים על שייקר סיבובי באינקובטור תרבית רקמות.
4. ב- DIV -4, חזור על שלב 1.2. הגלולה תהיה בעומק 2 - 4 מ"מ. החלף 30 מ"ל מדיום התמיינות בתוספת 6 מיקרומטר חומצה רטינואית all-trans (RA) לצלחת פטרי. חזרו לשייקר הסיבובי באינקובטור תרביות הרקמה למשך 48 שעות נוספות.
5. ב- DIV -2, חזור על שלב 1.3. הגלולה תהיה בעומק 4 - 8 מ"מ בשלב זה.
6. ב DIV -1, להכין משטחי ציפוי כמו בסעיף 2.
7. ב DIV 0, להפשיר 5 מ"ל של מדיום טריפסיניזציה NPC pre-aliquoted וקפוא ב 37 ° C במשך 5 - 10 דקות ומניחים במכסה מנוע תרבית רקמה. באמצעות פיפט 25 מ"ל, להעביר אגרגטים מבדילים לצינור חרוטי 50 מ"ל. אפשרו לאגרגטים להתיישב ושאפו בזהירות את המדיום. שטפו את הגלולה פעמיים עם PBS של 10 מ"ל, ואפשרו לצברים לשקוע בין השטיפות.
8. לאחר שטיפת PBS השנייה, להוסיף 5 מ"ל של מדיום טריפסיניזציה NPC לגלולה ולדגור ב 37 ° C במשך 5 דקות. בעדינות להעיף את הצינור לאחר 2.5 דקות.
9. יש להוסיף 5 מ"ל של מעכב טריפסין 0.1% פולי סויה (STI) כדי להשבית טריפסין ולערבב על-ידי היפוך. בעדינות triturate 10 - 15 פעמים עם צינור סרולוגי 10 מ"ל עד תרחיף תאים הומוגני יחסית מיוצר.
10. העבירו באיטיות את מתלה התא למסננת תאים של 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. לאחר שכל התרחיף סונן, הוסף 1 מ"ל של מדיום N2 כדי לשטוף את התאים הנותרים דרך המסנן וגלול את תרחיף התא המנותק למשך 6 דקות ב 200 x גרם.
11. יש לשאוף מדיום מבלי להפריע לכדור. יש לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל N2 בינוני, תאי גלולה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ו triturating בין שטיפות עם P1000. לפני השטיפה השנייה, לספור תאים באמצעות המוציטומטר.
12. תאי השעיה מחדש בתווך N2 ב- 1 x 10⁷ תאים למ"ל ו- ESN צלחת בצפיפות תאים של 150,000 - 200,000 תאים לסמ"ק².
13. העבר ESN מצופים חדשים לאינקובטור תרבית רקמה לח ב 37 ° C ו 5% CO₂ ולשמור כמו בסעיף 3.

2. הכנת משטחי תרבית לציפוי מבשרי עצבים ב- DIV 0

1. הכינו כלים שטופלו בתרבית רקמות לפחות יום אחד לפני הציפוי. הוסף כמות מספקת של פוליאתילניאמין (PEI; 25 מיקרוגרם/מ"ל ב-H₂O סטרילי) או פולי-D-ליזין (PDL; 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H₂O סטרילי) כדי לכסות צלחות פלסטיק שטופלו בתרבית רקמות ולדגור על O/N ב-37°C.
2. בבוקר הציפוי, שטפו כלים פעמיים עם H₂O מזוקק כפול ופעם אחת עם PBS. לאחר השטיפה הסופית, מוסיפים מספיק N2 בינוני כדי לכסות את התבשיל (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 12 באר או 4 מ"ל לכל צלחת 6 ס"מ).
3. הכינו כיסויי זכוכית בקוטר 18 מ"מ לפחות יום אחד לפני ציפוי נוירונים. נקו את הכיסויים על ידי ניקוי פלזמה למשך 4 דקות.
4. העבירו מיד כיסויים מנוקים לפרפילם שטוף אתנול בתחתית צלחת סטרילית גדולה והוסיפו 400 מיקרוליטר של תמיסת PEI או PDL, שהוכנה כמו בשלב 2.1. לדגור O/N ב 37 ° C באינקובטור תרבית רקמות.
5. בבוקר, יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים במים ולהוסיף 5 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS למשך שעה עד 3 שעות ב-37°C. לפני ניתוק נוירונים, שאפו את הלמינין והעבירו מיד את הכיסוי לבאר של צלחת בת 12 בארות המכילה 1 מ"ל של מדיום NPC, הקפידו לשמור על הצד המטופל פונה כלפי מעלה.
6. אחסנו את הכלים והכיסויים בטמפרטורה של 37°C עד שה-NPCs יהיו מוכנים לצלחת.

3. תחזוקה של נוירונים

1. ב DIV 1, לשאוף מדיום ולהחליף עם מדיום תרבות N2.
2. ב DIV 2 ו 4, לשאוף מדיום ולהחליף עם מדיום תרבית B27.
3. ב-DIV 8, יש לשאוף מדיום ולהחליף במדיום תרבית B27 המכיל מעכבי מיטוטי לסילוק תאים לא עצביים מזהמים.
4. ב- DIV 12, החלף במדיום תרבית B27.
5. אל תסיר ESN מסוג DIV 12⁺ מ-5% CO₂ עד שיהיה מוכן לשימוש.

Results

איור 1. ESN מותאמי מתלים נשארים יציבים מבחינה מיטוטית ומבטאים סמנים של פלוריפוטנציה.(A) סכמה של תחזוקה ובידול של ESC. נוכחות או היעדר חומצה רטינואית (RA) או גורם מעכב לוקמיה (LIF) מסומן על ידי + או –. השוואה בין ימים במבחנה (DIV) לבין שלבי התפתחות קלאסיים (DS) עבור תרביות נוירונים ראשוניות מסופקת. (B) שיעורי ההתרבות של קווי תאי R1, D3 ו-C57BL/6J ES מתייצבים ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נוקאאוט DMEM	לייף טכנולוגיות	10829-018	מדיה: מדיום תרבות ESC ניסוח והערות: 500 מ"ל
100x MEM NEAA	לייף טכנולוגיות	11140-050	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש ניסוח והערות: 6 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	6 מ"ל
FBS מוסמך ES	תאי גזע מיושמים	ASM-5007	90 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	3 מ"ל
55 מ"מ 2-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	21985-023	1.1 מ"ל
107 יחידות/מ"ל LIF	מיליפור	ESG1107	60 מיקרוליטר
נוקאאוט DMEM	לייף טכנולוגיות	10829-018	מדיה: מדיום בידול ESC ניסוח והערות: 436.6 מ"ל
100x MEM NEAA	לייף טכנולוגיות	11140-050	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש ניסוח והערות: 5 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	5 מ"ל
סרום מאושר ESC	תאי גזע מיושמים	ASM-5007	50 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
55 מ"מ 2-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	21985-023	0.9 מ"ל
PBS של דולבקו	סיגמא-אולדריץ'	D8537	מדיה: מדיום טריפסיניזציה NPC ניסוח והערות: 100 מ"ל
0.5 מטר EDTA (18.3%)	סיגמא-אולדריץ'	3690	מדיה: להקפיא ב 5 מ"ל aliquot ניסוח והערות: 0.266 מ"ל
טריפסין	סיגמא-אולדריץ'	T8802	50 מ"ג
פוליאתילנימין (PEI)	סיגמא-אולדריץ'	P3143	מדיה: פתרונות ציפוי פני שטח ניסוח והערות: 2.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
פולי-די-ליזין (PDL)	סיגמא-אולדריץ'	P7280	מדיה: יש להשתמש תוך 1 שבועות ניסוח והערות: 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020	5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	לייף טכנולוגיות	10565-018	מדיה: מדיום תרבות NPC ניסוח והערות: 492.5 מ"ל
100x N2 ויטמינים	לייף טכנולוגיות	17502-048	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש ניסוח והערות: 5 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
נוירובזל A	לייף טכנולוגיות	10888-022	מדיה: מדיום תרבות ESN ניסוח והערות: 482.5 מ"ל
50x ויטמינים B27	לייף טכנולוגיות	17504-044	מדיה: יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך חודש אחד לכל היותר ניסוח והערות: 10 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	5 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
5-פלואורו-2'-דאוקסיורידין (5FDU)	סיגמא-אולדריץ'	F0503	מדיה: 2000x מעכבים מיטוטיים aliquot ולאחסן ב -20 °C ניסוח והערות: dd 150 מ"ג 5FDU ו 350 מ"ג אורידין ל 10 מ"ל נוירובזל A. מסנן סטרילי, aliquot ולהקפיא. השתמש ב- 2000x במדיום תרבות ESN.
אורידין	סיגמא-אולדריץ'	U3003
טריפל אקספרס טריפסין	לייף טכנולוגיות	12605-010	מדיה: ניסוחים שונים והערות: חנות ב- RT
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D8418	store ב- RT
מעכב טריפסין פולי סויה (STI)	סיגמא-אולדריץ'	T6414	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	E7023	store ב- RT
חומצה אסקורבית	סיגמא-אולדריץ'	A4403	הכינו ציר של 100 מ"מ על ידי המסת 100 מ"ג חומצה אסקורבית ב-5.7 מ"ל של תערובת 50:50 DMSO/אתנול.
חומצה רטינואית (RA)	סיגמא-אולדריץ'	₪625	השהה 15 מ"ג RA ב 9 מ"ל 50:50 DMSO/אתנול. תוסף עם 1 מ"ל של 100 mM חומצה אסקורבית מלא. Aliquot ומאוחסן ב -80 °C. יציב במשך 6 חודשים.
מנקה פלזמה	האריק פלזמה	PDC-32G
אולימפוס IX51 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	לא ישים
כיסויי זכוכית 18 מ"מ	פישר	12-545-84
מסננת תאים (40 מיקרומטר)	פישר	08-771-1
סטובל רקדנית בטן שייקר	פישר	15-453-211
כלים עם הדבקה נמוכה	פישר	05-539-101	קורנינג 3262
מנות בקטריאליות	VWR	25384-302	100 x 15 מ"מ