הפרדה מגנטית של תאי Schwann מעצבים סיאטיים של עכבר

תקציר

מקור: Blusch, A., et al., In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי Schwann מסיבי עצב סיאטיים של עכבר.

פרוטוקול

1. תרבית תאי Schwann

1. ציפוי לתרבית תאי Schwann
   1. מצפים את כלי תרבית התאים בתנאים סטריליים. יש למרוח 2 מ"ל של 0.01% פולי-ל-ליזין (PLL) על שתי מנות תרבית רקמה (TC) בקוטר 60 מ"מ כל אחת ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   2. מוציאים את ה-PLL, שוטפים את צלחות ה-TC 2x במים מזוקקים, ודגרים עם 2 מ"ל של 1 מק"ג/ס"מ² למינין למשך הלילה ב-4°C. שוטפים את צלחות ה-TC 2x עם אקווה דסט ונותנים לצלחות להתייבש באוויר.
2. הכנה בינונית לתרבית תאי Schwann
   1. הכינו 50 מ"ל של מדיום תאי Schwann על ידי הוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 2 מיקרומטר פורסקולין, 10 ננומטר נוירגולין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ל-Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)/F-12 (גלוקוז גבוה) בתנאים סטריליים.
   2. הכינו 70 מ"ל של מדיום L-15 של לייבוביץ עם 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין בתנאים סטריליים.
3. עיכול אנזימטי של העצב הסיאטי
   הערה: השלבים הבאים מבוצעים בתנאים סטריליים.
   1. הכינו את תמיסת העיכול האנזימטית המכילה 0.25% dispase II, 0.05% collagenase מסוג I ו-50 מיקרוגרם/מ"ל gentamycin ב-10 מ"ל DMEM (גלוקוז גבוה).
   2. צנטריפוגה את הצינור ב 188 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant עם פיפטה סרולוגית 25 מ"ל, ולהעביר את הגלולה עם התווך L-15 של לייבוביץ הנותר לתוך צלחת תרבית רקמה 60 מ"מ באמצעות פיפטה 1,000 מ"ל.
   3. שוטפים את הצינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של פתרון העיכול האנזימטי ומוסיפים אותו לצלחת המכילה את סיבי העצבים. מפזרים את הרקמה בצלחת בזהירות עם קצה פיפטה כדי למקסם את פני השטח הנגישים לעיכול.
   4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 18 שעות, ולעצור את העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל של 40% FCS בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס, ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺ (HBSS).
4. הפרדת תאים
   1. מעבירים את העצבים המעוכלים לתוך צינור 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית וצנטריפוגה ב 188 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% FCS ו 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin. השהה מחדש את הגלולה 20 פעמים לאחר מכן, באמצעות 10 מ"ל, 5 מ"ל, 2 מ"ל, 1 מ"ל ו 200 מיקרוליטר פיפטה חוד.
   2. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר וצנטריפוגה במהירות של 188 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. השליך את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% FCS ו- 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין.
   3. הוסף 2 מ"ל של תרחיף התא לכל אחת משתי צלחות TC 60 מ"מ מצופות PLL ולמינין, ודגור ב-37°C ו-5% CO₂. השאירו את הלוחות ללא מגע במשך יומיים באינקובטור כדי להגן על התאים מפני לחץ מכני ולתמוך בהידבקות.
5. התמיינות תאי Schwann
   1. לאחר יומיים, הסר את המדיום ושטוף בזהירות את הצלחות 2x עם DMEM (גלוקוז גבוה), 10% FCS, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של מדיום תא Schwann. החלף את מדיום התא Schwann כל יום שני, והתבונן במראה התא ובמפגש באמצעות מיקרוסקופ.
6. טריפסיניזציה של תאים והפרדה מגנטית
   1. כאשר התאים מגיעים למפגש של כ 80% (6-12 ימים של תרבית), בזהירות לשטוף את הצלחות 2x עם 3 מ"ל של DPBS לדגור עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA (מחומם מראש ל 37 ° C) במשך 3 דקות. כאשר התאים מתנתקים מתחתית הצלחת, להשבית את העיכול על ידי תוספת של 2 מ"ל של DMEM עם 10% FCS ו 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin.
      הערה: היצמדו לזמן טריפסיניזציה של 3 דקות בלבד, והמשיכו במהירות לאחר מכן.
   2. השהה מחדש את גלולת התא ב-2 מ"ל של מאגר הפרדת תאים מגנטי המכיל DPBS עם אלבומין בסרום בקר (BSA) 0.5% ו-2 ננומטר EDTA. ערבבו 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן וספרו את התאים באמצעות תא צביעה.
   3. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 188 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 90 μL של חיץ הפרדת תאים מגנטי לכל 1 x 10⁷ תאים. הוסף 10 μL של מיקרו-כדוריות Thy-1 לכל 1 x 10⁷ תאים. השהה מחדש את התמיסה מספר פעמים ודגר במשך 15 דקות בחושך ב 8 מעלות צלזיוס.
   4. הוסף 2 מ"ל של מאגר הפרדת התאים המגנטי לתרחיף התא ולצנטריפוגה ב- 300 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. השליך את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב- 500 μL של מאגר הפרדת תאים מגנטי.
   5. יש להרטיב את עמוד הפרדת התאים המגנטי ב-1 מ"ל של מאגר הפרדת התאים המגנטי. מקם את עמודת הפרדת התאים המגנטית במפריד התא המגנטי. החל את התאים על עמודת הפרדת התאים המגנטית. לאסוף את הזרימה דרך צנטריפוגה ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
      הערה: פיברובלסטים נבחרים באופן חיובי ונשארים בעמודה, בעוד שתאי Schwann עוברים את העמודה. ניתן לאסוף פיברובלסטים עם חותמת (למשל, כבקרה שלילית לפרוטוקולי צביעת תאי Schwann).
   6. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום הקוקולטור. ספרו את התאים לאחר צביעה עם כחול טריפאן ותא צביעה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר	קרל רוט, קרלסרוהה, גרמניה	8076.4
מסננת תאים, 100 מיקרומטר	BD Bioscience, היידלברג, גרמניה	352360
צנטריפוגה 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, גרמניה	5811000015
אינקובטור CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, גרמניה	51017865
דיספאס השני	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	4942078001
מים מזוקקים (מערכת טיהור מים)	Millipore, Molsheim, צרפת	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה	31331093
DPBS (ללא יוני סידן וללא יוני מגנזיום)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	D8537-6X500ML
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	F7524	FCS חייב להיבדק עבור תרבית תאים Schwann
ג'נטמיצין	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה	5710064
HBSS (ללא יוני סידן וללא יוני מגנזיום)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה	14170138
למינין	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	L2020-1MG
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130042303
מיקרומספריים	Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה	15000-08
מיקרוסקופ	Motic, Wetzlar, גרמניה	מוטיק BA 400
שקופית מיקרוסקופ	VWR, Radnor, ארצות הברית	630-1985
מפריד MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130091632
עמודות MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-042-201
תא הספירה של נויבאואר	Assistant, Erlangen, גרמניה	40441
פיפטות	Eppendorf AG, Hamburg, גרמניה	2231300004
פולי-ל-ליזין	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	P4707-50ML
פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל	Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה	861254025
פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל	Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה	861685001
פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל	Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה	861253001
צלחת TC 60, תא +	Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה	833901300
מיקרו-כדוריות Thy-1 (ערכת MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-094-523
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה	25300-054
סוג I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה	C1639
אמבט מים סוג 1008	GFL, Burgwedel, גרמניה	4285