$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הכנת תמיסת פרוסה עתירת סוכרוז ונוזל מוחי מלאכותי (ACSF)
- לפני יום הניסוי
- הכן 1 ליטר של פרוסה 10x פרוסה מראש פתרון עם כיתה מעבדה סוג 1 מים המכילים (ב mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12.5 KH2PO4 (טבלה 1). על מנת למנוע משקעים של סידן זרחתי, ערבבו באיטיות את הכימיקלים בכד ממולא מראש ב-800 מ"ל H2O תוך ערבוב מתמיד עם בוחש מגנטי. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C או בטמפרטורת החדר (RT).
- ביום הניסוי
- הכינו 1 ליטר של 1x ACSF עם מים מסוג 1 המכילים (במ"מ): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 גלוקוז (טבלה 2). השתמש באוסמומטר לחץ אדים כדי לאמת את האוסמולריות בין 305-315 mOsm (pH ~ 7.55-7.6).
הערה: על מנת למנוע משקעים של סידן זרחתי, ערבבו באיטיות את כל הכימיקלים המוצקים בכוס מלאה מראש ב-800 מ"ל של H2O תוך ערבוב מתמיד עם מערבל מגנטי. הוסף MgSO4 ו CaCl2 ממש בסוף, לטפטף לאט את הסכום הדרוש מ 1 M פתרונות המלאי.
- בועבע ברציפות פתרון ACSF 1x ב- RT עם קרבוגן כדי להגדיר pH בין 7.3-7.4.
הערה: אם ה- pH מעט גבוה מדי או נמוך מדי, התאמות קטנות בחוזק הקרבוגנציה יספיקו. אם ה- pH גבוה מ- 7.45 עם קרבוגנציה, התאם אותו על ידי הוספת כמה טיפות של 1 M NaH2PO4 solution.
- הכינו 250 מ"ל (לכל מוח) של תמיסת פרוסה אחת עתירת סוכרוז בכד המכיל 25 מ"ל של 10x פרוסה לפני תמיסה ו-(במ"מ): 252 סוכרוז, 26 NaHCO3 ו-10 גלוקוז (טבלה 3). ודא שהאוסמולריות היא בין 320-325 mOsm (pH ~ 7.55-7.6).
- ערבבו את תמיסת הפרוסה עתירת הסוכרוז למשך 10–15 דקות עם קרבוגן כדי לשלוט ב-pH בין 7.3-7.4.
הערה: אם ה- pH גבוה מ- 7.45 עם קרבוגנציה, התאם אותו על ידי הוספת כמה טיפות של 1 M KH2PO4 solution.
- אחסנו את תמיסת הפרוסה עתירת הסוכרוז למשך 20-30 דקות במקפיא אולטרה (-80°C) עד להקפאה חלקית.
2. דיסקציה ומיקום של המוח המורין
- העבירו את המוח לצלחת התרבית המצוננת בקוטר 35 מ"מ והוציאו את כל חלקיקי השיער או הדם מהרקמה על ידי שטיפת המוח בעדינות עם פיפטת פסטר מלאה ב-ACSF (לדם יש השפעות ציטוטוקסיות על רקמת המוח).
- העבירו את המוח בעזרת המרית על נייר הפילטר הספוג על גבי צלחת התרבית המצוננת בקוטר 90 מ"מ (איור 1A).
- השתמש בלהב כדי לחתוך את המוח לשניים, להפריד בין שתי ההמיספרות, ומקם את שתי ההמיספרות בצד המדיאלי שזה עתה נחתך.
- השתמשו בלהב כדי להסיר את החלק הגבי (5%-10%) של המוח מכל חצי כדור עם חתך מקביל לחלק העליון הגבי (איור 1C), ומקמו את שתי ההמיספרות בצד שזה עתה נחתך, כשהחלק הגחוני של המוח פונה כלפי מעלה.
- הניחו טיפת דבק-על על צלחת הדגימה ופרשו כראוי עם קצה פיפטה כדי להכיל את שתי ההמיספרות.
- השתמש ברצועת נייר סינון כדי להרים חצי כדור אחד עם כוחות נימים על ידי נגיעה בצד הגחון עם רצועת נייר הפילטר, ובכך לא לפגוע ברקמה.
- השתמש ברצועת נייר מסנן נוספת כדי לייבש בזהירות למחצה את הצד הגבי של המוח לפני מיקום חצי הכדור, הצד הגבי כלפי מטה, על גבי הדבק על צלחת הדגימה. חזור על אותו הליך עם ההמיספרה השנייה.
הערה: יש למקם את ההמיספרות ביישור אופקי בצורה משוקפת על לוח הוויברטום, כאשר הצדדים הרוסטרליים מצביעים כלפי חוץ והצדדים הקאודליים פונים (אך לא נוגעים) זה בזה באמצע. הצדדים האמצעיים של שתי ההמיספרות צריכים להצביע לכיוון להב הוויברטום, והצדדים הצדיים לכיוון הנסיין (איור 1D).
- מניחים את צלחת הדגימה בתא החיתוך ובמהירות, אך בזהירות, מכסים אותה בפרוסת פרוסה עתירת סוכרוז קרה כקרח. ברגע שהתמיסה נוגעת בדבק, היא תתמצק ותדביק כראוי את ההמיספרות לצלחת הדגימה.
- ודא כי ההמיספרות מכוסות כראוי בתמיסת פרוסה עתירת סוכרוז ואשר כי התמיסה מבעבעת עם carbogen.
הערה: יש לבצע את כל הליך הדיסקציה מהר ככל האפשר. אנא ודא כי המוח אינו נשאר ללא אספקת חמצן במשך זמן רב מאוד. זה אמור לקחת רק כ 1-1.5 דקות מעריפת ראש לשקיעת המוח בחתיכת פרוסה עתירת סוכרוז. זוהי הדרישה הקריטית ביותר להכנת פרוסת מוח חריפה על מנת להצדיק איכות גבוהה של הפרוסה.
3. חיתוך אופקי של המוח
- מקמו את להב הוויברטומה מול הצד המדיאלי של ההמיספרות והורידו אותו לאותו גובה כמו הצדדים הגחונים של ההמיספרות הפונות כעת כלפי מעלה. מנמיכים את הלהב בעזרת בקרת הוויברטום ל-600 מיקרומטר נוספים בכיוון הגבי ומתחילים לחתוך. הלהב אמור לפגוע ברקמה (אם לא, להפוך את הלהב ולהוריד אותו עוד קצת). פורסים עד ששתי הפרוסות הראשונות מופרדות לחלוטין משתי ההמיספרות.
- הופכים את הלהב ומורידים עוד 300 מיקרומטר ופורסים שוב.
- כאשר ההיפוקמפוס הופך גלוי (השתמשו באטלס המוח של העכבר לעזרה, במידת הצורך) (איור 1E) אספו את הפרוסות עם פיפטת פסטר מפלסטיק מורחבת. אספו את הפרוסות עד שהפוטמן הקאודטי נראה לעין ליד ההיפוקמפוס. בדרך כלל, בין 8-12 פרוסות של 300 מיקרומטר (4-6 לכל חצי כדור) ניתן לאסוף עבור מוח העכבר.
- השתמשו בפיפטת פסטר מפלסטיק כדי לאסוף את הפרוסות והעבירו אותן לתא ההתאוששות באמבט המים (איור 1F) (אספו פרוסות אחרי כל סיבוב של חיתוך כדי למנוע מהן לצוף בתא הפרוסה).
הערה: עבדו מהר ככל האפשר וודאו שתמיסת הפרוסה עתירת הסוכרוז קרה כקרח ועוברת קרבוגניות במהלך כל ההליך. במידת הצורך, מלאו מחדש את הקרח המקיף את תא הפרוסה.
4. שחזור פרוסות מוח לרישומים אלקטרופיזיולוגיים
- השאירו את הפרוסות בתא התאוששות מלא ACSF באמבט מים של 32°C למשך שעה < / >
הערה: תאי התאוששות זמינים גם באופן מסחרי.
- הוציאו את חדר ההתאוששות מאמבט המים.
- הניחו את הפרוסות ב-RT למשך 30 דקות נוספות לפחות לשחזור לפני תחילת כל מריחה נוספת.
Buffer and Media Recipes.
טבלה 1: 10 x פרוסה מראש פתרון (1 L).
| תרכובת | ריכוז (mM) | משקל מולקולרי (גר'/מול) | סכום (גרם) |
| KCl | 25 | 74.55 | 1.86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2.94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246.48 | 2.46 |
| KH2PO4 | 12.5 | 136.08 | 1.7 |
טבלה 2: 1x ACSF (1 L) (אוסמולריות בין 305–315 mOsm).
| תרכובת | ריכוז (mM) | משקל מולקולרי (גר'/מול) | סכום (גרם) |
| NaCl | 125 | 58.44 | 7.3 |
| KCl | 2.5 | 74.55 | 0.19 |
| CaCl2 * 2H2O | 2 | מ- 1 M CaCl2 פתרון | 2 מ"ל |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | מ 1 M MgSO4 פתרון | 1 מ"ל |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156.02 | 0.2 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| גלוקוז * H2O | 25 | 198.17 | 4.95 |
טבלה 3: 1x תמיסת פרוסה עתירת סוכרוז (250 מ"ל) (אוסמולריות בין 320–325 mOsm).
| תרכובת | ריכוז (mM) | משקל מולקולרי (גר'/מול) | סכום (גרם) |
| רזולוציית פרוסה של 10x | לא ישים | לא ישים | 25 מ"ל |
| סוכרוז | 252 | 342.3 | 21.57 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 0.55 |
| גלוקוז * H2O | 10 | 198.17 | 0.49 |
