יצירת פרוסות אמיגדלה מוטות ממוח עכבר

תקציר

מקור: Bosch, D., et al. ex vivo דיסקציה אופטוגנטית של מעגלי פחד בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים יצירה של פרוסות אמיגדלה מוטות ממוח עכבר. המוח ממוקם בזווית על שלב דגימת הוויברטומה כדי לקבל פרוסות המכילות את האמיגדלה ואקסונים מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית שיוצרים קשרים סינפטיים עם האמיגדלה. פרוסות המוח נשמרות בטמפרטורה הפיזיולוגית כדי לשמר את הרקמה לניסויים נוספים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פרוסות חריפות

1. הכינו נוזל מוחי מלאכותי (ACSF), תמיסת חיתוך, כלים (מספריים, אזמל, מלקחיים, מרית, פיפטה פסטר) וקוביות אגר.
   הערה: 1 ליטר של נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) נדרש לכל ניסוי, והוא מוכן על ידי המסת כימיקלים בזיקוק כפול H₂O כפי שפורסם בעבר. פתרון חיתוך מוכן על ידי תוספת 200 מ"ל של ACSF עם 0.87 מ"ל של 2 M MgSO₄ תמיסת מלאי.
2. חמצון ACSF ותמיסת חיתוך לאורך כל הניסוי עם 95% O₂ ו 5% CO_2.
3. הרדמה עמוקה של עכבר באמצעות מכונת הרדמה של בעלי חיים קטנים באמצעות איזופלורן (3% בחמצן). בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה מגפיים לפני שתמשיך.
4. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים גדולים ומיד צננו את הראש בתמיסת חיתוך קרה כקרח.
5. יש לפתוח את הגולגולת על ידי חתך יחיד בקו האמצע מהקאודלי לרוסטרלי ולדחוף בעדינות חתיכות גולגולת לצדדים באמצעות מלקחיים. הסר במהירות את המוח על-ידי הרמה עדינה שלו מהגולגולת באמצעות מרית קטנה ומעוגלת. חותכים את המוח הקטן עם אזמל. הכניסו את המוח לתמיסת חיתוך קרה כקרח.
6. עבור קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית או אתרי הזרקת קליפת המוח האמצעית: יש לחתוך את החלק הקדמי של המוח (המכיל קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית) באמצעות אזמל ולשים בתמיסת חיתוך קרה כקרח עד לחיתוך.
7. הסר את תמיסת החיתוך העודפת עם נייר סינון והדבק את החלק האחורי של המוח על שלב הוויברטום.
8. עבור פרוסות אמיגדלה מוטות, הדביקו את המוח על גוש אגר (4%) חתוך בזווית של 35° (איור 1D, באמצע). עבור פרוסות אמיגדלה קורונלית, אתרי הזרקת גרעין גניקולאט מדיאלי/גרעין תלמי אינטרלמינרי אחורי (MGm/PIN) ואתרי הזרקת קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית, מדביקים את המוח ישירות על הבמה (איור 1D, משמאל ומימין). הניחו גוש אגר נוסף מאחורי המוח ליציבות בזמן החיתוך.
9. מקם את הבמה בתא חיתוך עם תמיסת חיתוך מחומצנת קרה כקרח הנשמרת ב -4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. הכינו פרוסות חריפות של האמיגדלה (320 מיקרומטר) באמצעות להב ספיר. הניחו פרוסות בתא ממשק המסופק עם ACSF מחומצן בטמפרטורת החדר (RT).
10. לאחר הכנת פרוסות אמיגדלה חריפה, מניחים את תא הממשק באמבט מים ב 36 מעלות צלזיוס כדי לשחזר פרוסות במשך 35 - 45 דקות. לאחר מכן, החזר את תא הממשק ל- RT.
11. במהלך תחילת שלב 1.10, חתכו פרוסות של אתרי ההזרקה כפי שתואר קודם עבור פרוסות אמיגדלה חריפות (שלבים 1.8 - 1.9). שחזור פרוסות באמבט המים אינו נדרש כאן. אופציונלי: כדי להעריך במהירות את מיקום אתר ההזרקה, צפו בפרוסות על סטריאוסקופ המצויד במנורת פלורסנט ובערכות סינון מתאימות.

תוצאות

איור 1. הזרקות סטריאוטקטיות, הכנת פרוסות מוח חריפות והדמיה של סיבים פרסינפטיים.(A, B) הזרקת וירוס סטריאוטקטית. א) תמונה של עכבר מורדם מונח במסגרת סטריאוטקטית עם גולגולת חשופה ופיפטה ההזרקה. כניסה: זום בתמונה של פיפטה בהזרקה מלאה בתמיסת וירוס מעורבבת עם ירוק מהיר. סרגל קנה מידה: 3 מ"מ. (B) סכמטי של גולגולת עכבר עם מיקומים מסומנים של חורי קידוח לאזורי הזרקה שונים. (

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (ACSF)
פתרונות תיקון פנימיים
מגנזיום סולפט Heptahydrate	Roth, גרמניה	P027.1	הכנת תמיסת מלאי 2M במים מטוהרים
כלי פריסה, מיקרום HM650V	Fisher Scientific, גרמניה	920120
יחידת קירור לכלי פריסה לרקמות, CU65	Fisher Scientific, גרמניה	770180
להב ספיר	סכיני יהלומים מדלאוור		הזמנה מותאמת אישית, בירור עם החברה
סטריאוסקופ, SZX2-RFA16	אולימפוס, יפן
מיקרוסקופ טלאי, BX51WI	אולימפוס, יפן
בקרת טמפרטורה לאמבטיה, TC05	Luigs &; Neumann, גרמניה	200-100 500 0145
נייר סינון תאית חנקתית לתא ממשק	Satorius Stedim Biotech, גרמניה	13006--50 ACN