יצירת פרוסת מוח קורונלית החושפת את אזורי האמיגדלה ממוח עכבר

Abstract

מקור: Bosch, D., et al. ex vivo דיסקציה אופטוגנטית של מעגלי פחד בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים הכנת פרוסות מוח קורונליות דקות ממוח מוריני, וחושף את אזורי האמיגדלה העשירים בקשרים סינפטיים מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית. לאחר מכן הפרוסות מתאוששות בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן כדי לשמור על הכדאיות העצבית.

Protocol

1. הכנת פרוסות חריפות

1. הכינו ACSF, תמיסת חיתוך, כלים (מספריים, אזמל, מלקחיים, מרית, פיפטה פסטר), ואבני אגר.
   הערה: 1 ליטר של נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) נדרש לכל ניסוי. כפי שפורסם בעבר, ACSF מוכן על ידי המסת כימיקלים ב- H2O מזוקק כפול. פתרון חיתוך מוכן על ידי תוספת 200 מ"ל של ACSF עם 0.87 מ"ל של 2 M MgSO₄ תמיסת מלאי.
2. חמצון ACSF ותמיסת חיתוך לאורך כל הניסוי עם 95% O₂ ו 5% CO₂.
3. מרדימים את העכבר עמוקות באמצעות מכונת הרדמה של בעלי חיים קטנים, באמצעות איזופלורן (3% חמצן). בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגת הגפיים לפני שתמשיך.
4. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים גדולים ומיד צננו את הראש בתמיסת חיתוך קרה כקרח.
5. פתחו את הגולגולת על ידי חתך יחיד בקו האמצע מהקאודלי לרוסטל ודחפו בעדינות חלקים מהגולגולת לצדדים באמצעות מלקחיים. הסר במהירות את המוח על-ידי הרמתו העדינה אל מחוץ לגולגולת באמצעות מרית קטנה ומעוגלת. חותכים את המוח הקטן עם אזמל. הכניסו את המוח לתמיסת חיתוך קרה כקרח.
6. עבור אתרי הזרקת קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית, השתמשו באזמל כדי לחתוך את החלק הקדמי של המוח (המכיל קליפת המוח הקדם-מצחית) והכניסו אותו לתמיסת חיתוך קרה כקרח עד לחיתוך.
7. הסר את תמיסת החיתוך העודפת עם נייר סינון והדבק את החלק האחורי של המוח על שלב הוויברטום.
8. עבור פרוסות אמיגדלה קורונליות, אתרי הזרקת MGm/PIN ואתרי הזרקת קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית, הדביקו את המוח ישירות על הבמה (איור 1D, מימין ומשמאל). הניחו גוש אגר נוסף מאחורי המוח ליציבות בזמן החיתוך.
9. הניחו את הבמה בתא חיתוך עם תמיסת חיתוך מחומצנת קרה כקרח הנשמרת בטמפרטורה של 4°C באמצעות יחידת קירור. בעזרת להב ספיר, מכינים פרוסות קורונליות של האמיגדלה. הניחו את הפרוסות בתא ממשק המסופק עם ACSF מחומצן ב-RT.

Results

איור 1. הזרקות סטריאוטקטיות, הכנת פרוסות מוח חריפות, והדמיה של סיבים פרסינפטיים. (א, ב) הזרקת וירוס סטריאוטקטית. א) תמונה של עכבר מורדם מונח במסגרת סטריאוטקטית עם גולגולת חשופה ופיפטה הזרקה. כניסה: התקרבו לתמונה של פיפטת ההזרקה המלאה בתמיסת וירוס מעורבבת בירוק מהיר. סרגל קנה מידה: 3 מ"מ. (B) סכמטי של גולגולת עכבר עם מיקומים מסומנים של חורי קידוח לאזורי הזרקה שונים. (...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נוזל מוחי מלאכותי (ACSF)	לקומפוזיציה ראו הפניות #16 ו- #23
פתרונות תיקון פנימיים	לקומפוזיציה ראו הפניות #16 ו- #23
כלי פריסה, מיקרום HM650V	Fisher Scientific, גרמניה	920120
יחידת קירור לכלי פריסה לרקמות, CU65	Fisher Scientific, גרמניה	770180
להב ספיר	סכיני יהלומים מדלאוור
סטריאוסקופ, SZX2-RFA16	אולימפוס, יפן