כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון
1. דיסקציה של DG (תזמון: 15 דקות)
- הכנת מדיית בידוד גרעינים 1 ו-2 (NIM1 ו-NIM2), מאגר הומוגניזציה (HB) ומדיית שטיפה (WM) (טבלה 1). הניחו את כל החוצצים, המדיה, הריאגנטים והכלים על קרח עד לצורך. הניחו את ההומוגנייזר Dounce (ראו טבלת חומרים) על קרח במהלך ההכנה (לפחות שעה לפני שלב ההומוגניזציה).
הערה: ניתן להכין ולאחסן NIM1 בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים. NIM2, HB ו- WM צריכים להיות מוכנים טריים.
זהירות: תמרן את dithiothreitol (DTT), מעכב פרוטאז וטריטון X-100 בזהירות. תרכובות אלה מגרות את העור והעיניים, רעילות בחריפות ומסוכנות לסביבה המימית. בזמן השימוש בכימיקלים אלה יש ללבוש כפפות מגן, בגדים, הגנה על העיניים והפנים, לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול ולהימנע משחרור לסביבה.
- המתת חסד של עכבר C57Bl/6J זכר בן 22 חודשים על ידי נקע צוואר הרחם בעקבות הליך לוח זמנים 1 של משרד הפנים.
הערה: ראו דיון לרציונל בנוגע לשימוש בעכבר בן 22 חודשים במחקר זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להתבצע בכל גיל לאורך תוחלת החיים.
- נתחו את המוח מעכבר שעבר המתת חסד והעבירו אותו לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ מלאה במי מלח חוצצים בפוספט 1x קר כקרח (PBS) (איור 1). מניחים את צלחת הפטרי על קרח. הסר את המוח הקטן באמצעות אזמל וחתך את המוח לשניים בין שתי ההמיספרות (לאורך ציר הסגיטל).
- ממלאים צלחת פטרי חדשה בקוטר 10 ס"מ ב-PBS קר כקרח ומניחים אותה על קרח. העבירו מחצית מהמוח לצלחת הפטרי החדשה. בעזרת משקפת, נתחו את ה-DG וחזרו על שלב זה כדי לקבל את ה-DG השני מהמחצית השנייה של המוח.
הערה: שלבים אלה (שלבים 1.2-1.4) הותאמו מהליך שתואר קודם לכן. חשוב להתקדם במהירות האפשרית בשלב זה כדי לשמור על שלמות התאים.
- מעבירים את שני ה-DGs לתוך ההומוגנייזר Dounce המקורר מראש ומוסיפים 1 מ"ל של HB קר.
2. דיסוציאציה של רקמות, בידוד גרעינים בודדים ואנטי-NeuN immunostaining (תזמון: 2 שעות)
- הומוגניזציה של הרקמה עם 10 פעימות של מזיק "A" רופף, ואחריו 15 שבץ של "B" הדוק pestle.
הערה: הומוגניזציה של הקפצה צריכה להתבצע עם טיט על קרח עם משיכות עדינות כדי להפחית את החום הנגרם על ידי חיכוך וקצף. יש לקרר מראש את כל המאגרים והציוד ולשמור על קרח במהלך ההליך.
- מעבירים את ההומוגנט לתוך צינור 15 מ"ל מקורר; לשטוף את הומוגנייזר Dounce עם 1 מ"ל של HB קר ולשלב לאותו צינור. הוסף 3 מ"ל HB לצינור 15 מ"ל ודגור 5 דקות על קרח. יש לערבב פי 2 על ידי היפוך הצינור בעדינות.
- יש להרטיב מראש מכסה מסננת של 70 מיקרומטר עם HB של 0.5 מ"ל מעל מבחנה של 50 מ"ל. סננו את מתלה הגרעינים משלב 2.2 על ידי הטיית צינור 15 מ"ל בעדינות לתוך מסננת התא. לשטוף את מסננת התא עם 0.5 מ"ל של HB.
- הסר את מסננת התא וצנטריפוגה את המבחנה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, באמצעות צנטריפוגת דלי נדנדה. בטל את supernatant.
הערה: מאמץ ההומוגנט יסייע להפחית את הפסולת, שהיא קריטית לציטומטריית הזרימה ולריצוף הרנ"א של הגרעינים הבודדים (snRNA-seq) במורד הזרם.
- יש להשהות את הגלולה בעדינות ב-4 מ"ל HB באמצעות פיפטה P1000. דוגרים על קרח במשך 5 דקות. סחרור ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 3 מ"ל של WM.
- הרטיבו מראש מכסה מסננת של 35 מיקרומטר מעל מבחנה של 15 מ"ל עם 0.5 מ"ל של זיכרון עבודה. סננו את מתלה הגרעינים משלב 2.5 דרך מסננת התא, תוך פיפטציה עדינה של 0.5 מ"ל בכל פעם באמצעות פיפטה P1000.
- שטפו את מכסה המסננת עם 0.5 מ"ל של זיכרון עבודה והניחו את הצינור על קרח. מעבירים את התסנין לצינור וצנטריפוגה חדשים של 15 מ"ל למשך 5 דקות ו-4 מעלות צלזיוס ב-500 x גרם. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל זיכרון עבודה.
- סחרור ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של זיכרון עבודה עם העכבר אנטיגן גרעיני אנטי עצבי (NeuN), AlexaFluor 488-נוגדן מצומד (anti-NeuN-AF488, 1:32,000) ו 1 מיקרוגרם / מ"ל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). דגירה במשך 45 דקות על קרח בחושך.
הערה: כדי לייעל את immunostaining של גרעינים מבודדים, מומלץ titrate הנוגדן כדי לקבוע את דילול אופטימלי עבור ניתוח ציטומטריה זרימה ומיון. לאחר מכן, הפעל בקרות מתאימות כדי לוודא שתנאי הצביעה אופטימליים. לדוגמה, עם נוגדן אנטי-NeuN-AF488 מצומד, הופעלו בקרה שלילית (כלומר, ללא תוספת של הנוגדן, איור 2A) ובקרה חיובית (כלומר, צביעה עם הנוגדן, איור 2B) כדי להעריך הפרדה בין אוכלוסיות לא מוכתמות ומוכתמות. כאשר מתחילים לעבוד עם נוגדן מצומד AF488, מומלץ להפעיל בקרת איזוטיפ מצומד AF488 כדי להעריך ספציפיות. אם נעשה שימוש בנוגדן לא מצומד, ייתכן שיהיה צורך בבקרה נוספת כגון הוספת נוגדן משני רק להכנת גרעינים כדי להעריך קשירה לא ספציפית של הנוגדן המשני.
3. מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FANS) להרחקת אוכלוסיות נוירונים (תזמון: 45 דקות)
- העבר את תרחיף הגרעינים המוכתמים במערכת החיסון למבחנה של 5 מ"ל ושמור אותו על קרח עד לתחילת הליך ציטומטריית הזרימה.
הערה: אם עובדים עם חתיכות רקמה גדולות יותר משני DG עכברים, ייתכן שיהיה צורך בדילול נוסף עם מאגר זיכרון העבודה כדי למנוע סתימת ממיין התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) אם צפיפות הגרעינים בתמיסה הופכת גבוהה.
- מערבול את הדגימות במשך 3 שניות במהירות נמוכה לפני הכנסת הצינורות למכשיר FACS (ראה טבלת חומרים).
הערה: (הגדרת FACS) יש ליישר את מכונות המיון בתחילת ההליך עם חלקיקי כיול בהתאם להמלצות היצרן. עיכוב הנפילה כויל באמצעות חרוזים או מיקרוספרות (ראו טבלת חומרים) על פי מודל FACS. הדגימות מוינו ב 4 ° C במצב טוהר. כדי להקטין את נפח האיסוף, הגרעינים מוינו דרך פייה של 70 מיקרומטר בלחץ המומלץ עבור ציטומטר הזרימה. גרעינים מוינו לצינורות קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל (ראו טבלת חומרים) שהכילו 50 מיקרוליטר זיכרון עבודה. כל צינורות האיסוף צופו באלבומין סרום בקר PBS + 5% (BSA) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להפחית את הסיכון להידבקות גרעינים לדפנות הצינור.
- כדי לקבל את הנתונים מדגימה של תרחיף הגרעינים המוכתמים, קבעו את השערים בגובה DAPI ובאזור DAPI כדי להוציא את פסולת התא ואת הגרעינים המצטברים (איור 3A). יתר על כן, הפרידו גרעינים בודדים מכל הצברים או פסולת התא המוכתמים ב-DAPI על-ידי הגדרת השערים באזור פיזור צד היומן (SSC) ובאזור פיזור היומן קדימה (FSC) (איור 3B).
- הגדר את השערים עבור האנטי-NeuN-AF488 ואזור FSC, כדי לבודד את האוכלוסייה השלילית של NeuN-AF488, כפי שמוצג באיור 3C.
- לאחר ניתוח, תוך שימוש באסטרטגיית gating שתוארה לעיל, מיין את האוכלוסייה השלילית NeuN-AF488 בצינור איסוף של 1.5 מ"ל מלא ב- 50 μL של WM.
הערה: בעקבות אסטרטגיית ה-gating שתוארה לעיל והליך הדיסקציה לבידוד ה-DG ממוחו של עכבר בוגר, אוכלוסיית NeuN-AF488-negative צפויה לייצג ~14% מהגרעינים הבודדים.
טבלה 1: קומפוזיציות של מדיה ומאגרים ששימשו במחקר.
| Nuclei isolation medium #1 (NIM1) – לאחסן עד 6 חודשים ב-4°C |
| רכיב | נפח (μL) | ריכוז סופי (mM) |
| 1.5 מטר סוכרוז | 1,833.30 | 250 |
| 1 מטר KCl | 275 | 25 |
| 1 מטר MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 מטר מאגר טריס, pH 8.0 | 110 | 10 |
| מים ללא Nuclease | 8,726.70 | - |
| עוצמת קול כוללת | 11,000 | - |
| Nuclei isolation medium #2 (NIM2) – לעשות טרי |
| רכיב | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| צרפת | 10,769 | - |
| 1 מ"מ DTT | 11 | 1 מיקרומטר |
| מעכב פרוטאז 100x | 110 | 1x |
| טריטון X-100 10% (v/v) | 110 | 0.1% (V/V) |
| עוצמת קול כוללת | 11,000 | - |
| חוצץ הומוגניזציה (HB) – לעשות טרי |
| רכיב | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| צרפת | 10,958.75 | - |
| מעכב RNase, 40 U μL-1 | 27.5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | 13.75 | 50 U מ"ל-1 |
| עוצמת קול כוללת | 11,000 | - |
| Wash Media (WM) |
| רכיב | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| BSA 7.5% | 1,466.70 | 1% |
| מעכב RNase, 40 U μL-1 | 27.5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | 13.75 | 50 U מ"ל-1 |
| PBS | 9,492.05 | - |
| עוצמת קול כוללת | 11,000 | - |
