בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

תקציר

מקור: Zhang, H. et al. בידוד של תאי מיקרוגליה ראשוניים של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של דמיאלינציה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. חומרים

1. הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול:
   1. הכינו את מאגר ההעמסה על ידי הוספת נסיוב בקר עוברי (FBS, 2%) למלח חוצץ פוספט (PBS).
   2. הוסף צבע אדום נייטרלי (NR) (סופי 1%) ל- PBS.
2. הכינו את הפתרונות הבאים באמצעות הערכה המסחרית לדיסוציאציה מוחית למבוגרים (ראו טבלת חומרים).
   1. כדי להכין אנזים לערבב 1, פיפטה 1.9 מ"ל של Buffer Z ו 50 μL של אנזים P לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   2. כדי להכין אנזים לערבב 2, פיפטה 20 μL של Buffer Y ו 10 μL של אנזים A לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
   3. הכינו את הפתרון לפינוי פסולת.

2. זילוח עכברים ודיסקציה

1. תוך צפקית (כלומר) להזריק לעכבר 500 μL של 1% צבע NR ב PBS 2-3 שעות לפני הרדמה.
   הערה: הזרקה תוך-צפקית של NR במודלים של עכברים דה-מיאלינציה מסייעת להבחין בנגעים (איור 1).
2. מרדימים את העכבר בפנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, כלומר מורדמים), ומוודאים שהעכבר מורדם בהצלחה על ידי בחינת תגובות הכאב.
3. פתח את חלל החזה של העכבר וחשף את הלב.
4. בזהירות לחתוך פינה קטנה של אטריום ימין intracardially לחורר את העכבר עם 20-30 מ"ל של PBS קר מהחדר השמאלי.
5. ערפו את ראשו של העכבר בהרדמה.
6. פתח את גולגולת העכבר ושחרר בזהירות את המוח מהגולגולת.
7. מעבירים את המוח למוח העכבר פורסים תבנית וחותכים את המוח לפרוסות של 0.1 ס"מ.
8. מוציאים את פרוסות המוח ומניחים אותן ב-PBS קר בצלוחית פטרי (60/15 מ"מ). באמצעות מלקחיים מיקרוכירורגיים, לנתח במיקרו את הנגעים המסומנים על ידי צבע NR סביב כפיס המוח תחת סטריאומיקרוסקופ.
   הערה: ודא שהרקמה המנותחת שלמה ככל האפשר כדי להקל על ההעברה הבאה; יש להשלים את התקדמות הדיסקציה הכוללת תוך שעתיים.
9. העבר את הרקמה המנותחת לצינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל המכילים את הכמות המתאימה של מאגר עומס קר.
   הערה: אגרו את רקמת כפיס המוח מ-2-3 עכברים יחד בצינור אחד כדגימה אחת.

3. דיסוציאציה של רקמות

1. צנטריפוגה את הרקמה המנותחת ב 300 ×g במשך 30 שניות (לאחר שהגיע למהירות זו) כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
2. מחממים מראש אנזימים לערבב 1 ו 2 עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
3. יש להוסיף 1,950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים שחוממה מראש 1 לדגימה אחת ולעכל באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
4. מוסיפים 30 μL של אנזים שחומם מראש 2 ומערבבים בעדינות.
5. מעכלים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות ומערבבים בעדינות כל 5 דקות.
6. יש להוסיף 4 מ"ל של PBS קר לצינור לאחר העיכול ולנער בעדינות.
7. הניחו מסננים של 70 מיקרומטר על צינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל והרטיבו מראש את המסננים ב-500 מיקרומטר של PBS קר. סנן את הרקמה המנותקת על ידי העברת דגימות הרקמה המעוכלת דרך המסננים, והעבר את התרחיף המסונן בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   הערה: דלג על שלב זה אם כמות הרקמה קטנה מדי.
8. צנטריפוגה את דגימות הרקמה המסוננת ב 300 ×g במשך 10 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant לאט ושלם.
   הערה: כל השלבים צריכים להתבצע על קרח למעט העיכול האנזימטי.

4. פינוי פסולת

1. השהה מחדש את כדורית התא בעדינות עם 1,550 מיקרוליטר של PBS קר.
2. מוסיפים 450 μL של תמיסה קרה להסרת פסולת ומערבבים היטב.
3. שכבו את התערובת הנ"ל לאט ובעדינות עם 2 x 1 מ"ל של PBS קר באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
   הערה: הטה את צינור הצנטריפוגה ב -45 ° והוסף לאט PBS לאורך דופן הצינור עם הפיפטה.
4. מעבירים את הצינור לאט ובעדינות לצנטריפוגה ומסתובבים בטמפרטורה של 4°C ו-3,000 × גרם למשך 10 דקות.
5. חפשו שלוש שכבות אחרי הצנטריפוגה. שאפו את שתי השכבות העליונות לחלוטין באמצעות פיפטה של 1,000 μL (איור 2).
6. מלא את הצינור עד 5 מ"ל במאגר העמסה קר והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים.
7. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C ו-1,000 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והימנעו מהפרעה לכדורית התא.

5. הפרדה מגנטית של תאי מיקרוגליאה

1. השהה מחדש את גלולת התא עם 90 μL של מאגר העמסה והוסף 10 μL של חרוזי CD11b (מיקרוגליה).
2. מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות ב-4°C.
3. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ העמסה ומפיפטים בעדינות את הנוזל מעלה ומטה עם פיפטה של 1,000 μL כדי לשטוף את התאים לאחר הדגירה. צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 4°C ו-300 × גרם למשך 10 דקות ושאפו את הסופרנאטנט לחלוטין להסיר את החרוזים הלא קשורים.
4. להשעות מחדש את התאים ב 500 μL של מאגר טעינה.
5. מקם את עמודת MS עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.
6. שטוף את העמוד עם 500 μL של מאגר העמסה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
7. החל את השעיית התא על עמודת MS ומחק את הזרימה המכילה תאים ללא תווית.
8. הוסף 500 μL של מאגר טעינה לעמודה שלוש פעמים כדי לשטוף תאים הנצמדים לדופן העמוד ולהשליך את flowthrough.
   הערה: הוסף מאגר טעינה חדש לשטיפה רק כאשר מאגר העמודים ריק.
9. הסר את העמוד מהמפריד לאחר שטיפת העמוד והנח אותו על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
10. הוסף 1 מ"ל של מאגר טעינה לעמודה ודחוף את הבוכנה לתחתית כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית. חזור על שלב זה שלוש פעמים כדי לאסוף לחלוטין את התאים המסומנים מגנטית.

תוצאות

איור 1: תמונות של נגעי דה-מיאלינציה מוקדיים המסומנים על-ידי הצבע האדום הניטרלי.

איור 2: תמונות של שלוש השכבות שנוצרו על-ידי צנטריפוגה. יש להסיר את שתי השכבות העליונות (שכבה 1 + שכבה 2) בתהליך פינוי הפסולת (ראה שלב פרוטוקול 4.5).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגה	ביופיל	CFT001015
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות	ביופיל	CFT011150
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה	ביופיל	CFT011500
70 מיקרומטר מסנן	Miltenyi ביוטק	130-095-823
ערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים, עכבר וחולדה	Miltenyi ביוטק	130-107-677
עכברי C57BL/6J	מעבדות SJA
CD11b (מיקרוגליה) חרוזים, אדם ועכבר	Miltenyi ביוטק	130-093-634
סרום בקר עוברי	בוסטר	PYG0001
MACS MultiStand	Miltenyi ביוטק	130-042-303
מפריד MiniMACS	Miltenyi ביוטק	130-042-102
עמודות MS	Miltenyi ביוטק	130-042-201
אדום נייטרלי	סיגמא-אולדריץ'	1013690025
PBS	בוסטר	PYG0021
פנטוברביטל	סיגמא-אולדריץ'	P-010
סטריאומיקרוסקופ	משוט	MZ62