כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת הפתרון
- צלחות NGM-אגר (1 ליטר)
- הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של מדיה פפטון (למשל, Bacto-Peptone), ו 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל ב 95% אתנול [EtOH] מלא), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 25 מ"ל של 1 M K2PO4, ו 1 מ"ל של אמפוטריצין B (2.5 מ"ג / מ"ל מלאי).
- צלחות RNAi NGM-אגר (1 ליטר)
- הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של מדיה peptone, ו 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving להוסיף, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג / מ"ל ב 95% מלאי EtOH), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 25 מ"ל של 1 M K2PO4, 1 מ"ל של אמפוטריצין B (2.5 מ"ג / מ"ל מלאי), 1 מ"ל של 1 M isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ו 1 מ"ל carbenicillin (50 מ"ג / מ"ל).
- לוריא-ברטאני (LB)-אגר (1 ליטר)
- הוסף 10 גרם של peptone media, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, 20 גרם של אגר, 10 מ"ל של 1 M Tris pH 8.0. הוסף H2O ל- 1 L. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל carbenicillin ו 2.5 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל טטרציקלין.
- ליברה בינונית (1 ליטר)
- הוסף 10 גרם של peptone media, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של NaCl, ו 10 מ"ל של 1 M Tris pH 8.0. הוסף H2O ל- 1 L. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל carbenicillin.
- M9-חוצץ (1 ליטר)
- הוסף 6.0 גרם של Na2HPO4, 3 גרם של K2PO4, 5 גרם של NaCl, ו 50 מ"ג של ג'לטין. לפני השימוש, יש להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO4.
- פתרון הלבנה (10 מ"ל)
- הוסף 1 מ"ל של NaClO ו 2 מ"ל של 5 N NaOH. הוסף H2O ל 10 מ"ל.
2. הכנת צלחות RNAi
הערה: C. elegans מתורבת בדרך כלל במעבדה על לוחות פטרי בגודל 6 ס"מ המכילים 7.5 מ"ל של אגר בינוני גידול נמטודה (NGM-Agar). פרוטוקול זה מותאם לתולעים הנשמרות בטמפרטורה של 15°C. כדי להכין צלחות עם גז טבעי טבעי, השתמשו בטכניקות סטריליות סטנדרטיות למניעת זיהום פטרייתי וחיידקי. להלן הפרוטוקול להכנת לוחות NGM בתוספת ריאגנטים ל-RNAi.
- הכינו לוחות NGM-Agar RNAi בקוטר 6 ס"מ המכילים 1 mM IPTG ו-50 μg/mL carbenicillin. תנו להם להתייבש במשך 24 – 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
- שמור על צלחות RNAi ב 4 ° C בחושך. אין להשתמש אם המוצר עולה על 14 ימים.
- בחר את שיבוט חיידקי ה-RNAi (Escherichia coli HT115) המכיל את פלסמיד L4440 עם רצף ה-DNA של הגן lin-53 ממלאי הגליצרול הקפוא מספריית ה-RNAi הזמינה13 על לוחות LB-אגר המכילים 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין באמצעות תבנית פסים תלת פאזית. לגדל את החיידקים ב 37 ° C במשך הלילה. שיבוט זה מאפשר ייצור תלוי IPTG של lin-53 dsRNA בחיידקים.
- בנוסף, לגדל חיידקי RNAi המכילים פלסמיד L4440 ללא כל רצף גנים כמו בקרת וקטור ריק.
- למחרת, בחרו מושבה בודדת מלוחות lin-53 או וקטורים ריקים LB-agar באמצעות קצה פיפטה של 200 μL וחסנו כל אחד מהם לצינור תרבית נפרד המכיל 2 מ"ל של מדיום LB נוזלי בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצלין. לגדל תרביות לילה ב 37 ° C עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר של 0.6 – 0.8. מדידת OD באמצעות spectrophotometer.
זהירות: מצע LB נוזלי לא צריך להכיל טטרציקלין בניגוד לצלחת LB-אגר המשמשת להוצאת החיידקים ממלאי הגליצרול, שכן הכללת טטרציקלין במהלך האכלה מובילה לירידה ביעילות RNAi.
- הוסף 500 μL מכל תרבית חיידקים (lin-53 או וקטור ריק) ללוחות NGM-Agar RNAi בקוטר 6 ס"מ באמצעות מולטיפיפטה. יש לדגור על צלחות עם מכסה סגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך לייבוש. במהלך תקופה זו, ה-IPTG בלוחות ה-NGM יגרום לייצור dsRNA בחיידקים.
- השתמשו לפחות ב-3 צלחות לכל תרבית חיידקים בכל ניסוי. זה יספק 3 עותקים טכניים לכל ניסוי.
- אחסנו צלחות RNAi מיובשות של NGM-agar עם חיידקים בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך עד שבועיים.
3. הכנת זן C. elegans BAT28
- שמור על זן התולעת BAT288 המכיל את הטרנסגנים otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ו-ntIs1 [gcy-5prom::gfp] על חיידקי OP50 באמצעות לוחות NGM-אגר סטנדרטיים בטמפרטורה של 15°C.
הערה: לפרוטוקול מפורט על תרבית נמטודות, ראה. רול-6(su1006) הוא אלל דומיננטי וסמן הזרקה פנוטיפי נפוץ16 הגורם לתנועת הגלגול האופיינית. הוא משמש בטרנסגן otIs305 כדי לעקוב אחר hsp-16.2prom::che-1.
- שמור על זן BAT28 על 15 ° C בכל עת על מנת למנוע הפעלה זהירה של טרנסגן hsp-16.2prom::che-1. הפחיתו את החשיפה לטמפרטורות גבוהות מ-15°C תוך התמודדות עם המתח ככל האפשר.
- כדי לסנכרן תולעים עם גיל, השתמש בטכניקת ההלבנה.
- יש לשטוף צלחות NGM-Agar בקוטר 6 ס"מ המכילות בוגרים וביצים של BAT28 באמצעות חיץ M9 900 μL. תולעי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 900 x גרם במשך 1 דקה. הסר את supernatant.
- הוסף 0.5 – 1 מ"ל של תמיסת הלבנה ונער את הצינור במשך כדקה עד שתולעים בוגרות מתחילות להתפוצץ. צג באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי.
- תולעי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 900 x גרם במשך 1 דקה. להסיר את supernatant.
- שטפו את גלולת התולעת 3 פעמים על ידי הוספת 800 μL של חיץ M9 וצנטריפוגות ב 900 x גרם.
- הניחו את הביצים הנקיות על צלחות NGM טריות שנזרעו בחיידקי OP50. לגדל אוכלוסייה מולבנה על חיידקי OP50 ב 15 ° C עד שהם מגיעים לשלב L4 (כ 4 ימים). ניתן לזהות זחלי L4 על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך הצד הגחוני של התולעת18 באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי.
הערה: כדי להשיג את פנוטיפ המרת תאי הנבט לנוירונים עם דלדול לין-53, הוא צריך להתרוקן בדור ההורים (P0). הניקוד עבור פנוטיפ ההמרה מתבצע בדור הבא (דור F1). כדי להשיג את lin-53 מדולדל כבר P0, בעלי חיים L4 נתונים RNAi.
- העבר ידנית 50 תולעי שלב L4 לכל שכפול באמצעות חוט פלטינה ללוח NGM שאינו מכיל חיידקים כלשהם ואפשר לתולעים להתרחק מכל חיידק OP50 שהועבר. תן לתולעים לנוע על הצלחת במשך כ 5 דקות. השתמשו בחיידקים מלוחות ה-RNAi של NGM-Agar שנזרעו בעבר עם חיידקי lin-53 RNAi (או בקרת וקטורים ריקים) כדי להעביר ללוחות ה-RNAi המתאימים.
- הימנעו מהעברת חיידקי OP50 לצלחות ה-RNAi בפועל. עבוד במהירות כדי למזער את זמן החשיפה של הזן לטמפרטורות גבוהות מ -15 מעלות צלזיוס.
- לדגור על תולעים על לוחות RNAi NGM-Agar בטמפרטורה של 15°C למשך כ-7 ימים עד שצאצאי F1 של התולעים מגיעים לשלב L3-L4. ניתן להפריד אותם בבירור מבעלי החיים P0 מכיוון שהם גדולים ועבים יותר מצאצאי F1.
- בדקו ויזואלית תחת סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי אם תולעי צאצאי F1 מראות את הפנוטיפ הבולט של הפות (pvul) כפי שמוצג באיור 1. RNAi נגד lin-53 יש השפעות pleiotropic וגורם פנוטיפ pvul אשר ניתן להשתמש בו כדי להעריך אם RNAi נגד lin-53 היה מוצלח.
הערה: RNAi נגד lin-53 יכול גם לגרום קטלניות של עוברי F1. השפעה זו גוברת אם הלוחות נחשפים למעלות גבוהות יותר מ-15 מעלות צלזיוס לפני שבעלי החיים הגיעו לשלב L3-L4. עוברים מתים יכולים להיות מזוהים על ידי התפתחות נעצרת וחוסר בקיעה.
- דגרו על צלחות בחושך מכיוון ש- IPTG רגיש לאור.
4. השראת תכנות מחדש של תאי נבט
- אינקובט בדק לוחות RNAi המכילים lin-53 וצאצאי F1 וקטוריים ריקים שטופלו ב-RNAi במשך 30 דקות ב-37°C בחושך כדי להפעיל את CHE-1. השתמש באינקובטור מאוורר מכיוון שהוא מאפשר הלם חום יעיל יותר.
- אפשרו לבעלי חיים שסבלו מהלם חום להתאושש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך ולאחר מכן לדגור על צלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך.
- באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופ סטנדרטי המחובר למקור אור פלואורסצנטי, בחנו חיות מתחת למסנן החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) עבור אותות שמקורם ב-gcy-5prom::gfp באזור אמצע הגוף של התולעים, כפי שמוצג באיור 2. הגדר מיקרוסקופ עבור אותות GFP: עירור מרבי ב 488 ננומטר עם פליטה מקסימלית ב 509 ננומטר.
- הערך את מידת המרת תאי הנבט לנוירונים על ידי הרכבת בעלי חיים עם אותות GFP באזור אמצע הגוף על שקופיות מיקרוסקופיה המכילות כרית אגר.
- ספרו את מספר בעלי החיים המראים את תא הנבט להמרת תאי עצב לעומת החיות הכהות כדי להעריך את חדירת הפנוטיפ. בדרך כלל, כ-30% מבעלי החיים מראים אותות GFP בדידים בקו הנבט עם דלדול lin-53, בעוד שלא יותר מ-5% מהחיות מראות אותות GFP מפוזרים בקו הנבט על RNAi וקטורי ריק.
