$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כתב ויתור: כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הומוגניזציה מכנית של המוח וחוט השדרה
הערה: הכרכים המתוארים בסעיף זה מספיקים להומוגניזציה של חצי מוח או חוט שדרה.
- מצננים מראש את מכתש הזכוכית של מטחנת הרקמות Dounce (טבלת חומרים) המונחת על קרח.
- מוסיפים 3 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) מקוררת מראש למכתש.
- מעבירים את הרקמה (מוח או חוט שדרה) מהבאר של צלחת 6 הקידוחים לטיט הזכוכית, ומוודאים שהיא טבולה ב- 1x HBSS ויושבת בתחתית המליטה.
- לרסק בעדינות את הרקמה עם 10 פעימות של pestle A ואחריו 10 שבץ של pestle B. להעביר את תערובת הומוגנית לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
- מלא את הצינור לנפח סופי של 10 מ"ל באמצעות HBSS 1x מקורר מראש וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 320 x גרם ב 4 ° C.
- שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1x HBSS קר כקרח לכל צינור עד לנפח סופי של 7 מ"ל והשעו מחדש בעדינות את הגלולה על ידי מערבולת.
2. פינוי פסולת
הערה: הסרת פסולת, המורכבת בעיקר מרקמה לא מעוכלת ומעטה מיאלין, היא צעד קריטי כדי לאפשר צביעה יעילה של הומוגנט הרקמה לצורך ניתוחים ציטומטריים של זרימה לאחר מכן.
- סנן כל דגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר גושי רקמה לא מעוכלים. שלב זה חשוב במיוחד בעבודה עם רקמות חוט השדרה, מכיוון שדגימות אלה נוטות יותר להכיל שברי עצבים לא מעוכלים או קרומי המוח שעלולים להשפיע על השלבים הבאים.
- ודא כי נפח הסופי הוא 7 מ"ל בכל צינור דגימה. אם לא, מלאו ב-HBSS אחד קר כקרח עד 7 מ"ל.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת פרקול איזוטונית מקוררת מראש (IPS) לכל דגימה כדי ליצור נפח סופי של 10 מ"ל של תמיסה המכילה מדיום שיפוע צפיפות בריכוז סופי של 30%. ערבבו בעדינות את הדגימות כדי לוודא שהן מעורבבות בצורה הומוגנית.
- דגימות צנטריפוגות למשך 15 דקות ב-700 x גרם ב-18°C, ומקפידות לכוון את תאוצת הצנטריפוגה ל-7 ואת הבלם ל-0.
הערה: הצנטריפוגה אמורה להימשך כ-30 דקות.
- הסר בעדינות את הדגימות מהצנטריפוגה.
הערה: דיסק לבנבן המורכב מפסולת ומיאלין צריך להיראות צף על פני השטח של התמיסה. גלולה (המכילה את התאים המעניינים) צריכה להיות גלויה בתחתית הצינור.
- בזהירות לשאוף את כל דיסק לבנבן של פסולת ולאחר מכן את שאר supernatant, לוודא לא לעקור את הכדור. השאירו כ-100 מיקרוליטר של תמיסה על גבי גלולת התא כדי למנוע את הסיכון של עקירה בשוגג.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימת ציטומטריית זרימה (FACS) (BL), השעה מחדש את הגלולה על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר, והעבר דגימות לצינורות 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 450 x גרם בטמפרטורת החדר (RT).
- שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בחיץ המתאים המתאים לניתוחים במורד הזרם