$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת החומרים
- מאגר מיון תאים המופעל על ידי מגנטית (MACS): הכן 2 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ו 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) (טבלה של חומרים) ב PBS-/-.
- תמיסת מלאי Collagenase IV (20 U/μL): יש להשעות מחדש את האבקה ב-PBS+/+ (טבלת חומרים), aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
הערה: Collagenase IV דורש MgCl2 להיות פעיל באופן מלא; אין להקפיא-להפשיר תמיסת Collagenase IV.
- תמיסת הרדמה-משככת כאבים: מערבבים 150 מיקרוליטר קטמין (150 מ"ג/ק"ג), 25 מיקרוליטר קסילזין (5 מ"ג/ק"ג), ו-330 מיקרוליטר של buprecare (0.1 מ"ג/ק"ג) ב-1 מ"ל של PBS-/-.
הערה: הכינו פתרון הרדמה-משכך כאבים באופן זמני ואל תשמרו אותו יותר מיום.
- תמיסת הפרין (100 U/mL): יש להשהות מחדש את האבקה ב-PBS-/-.
- הכינו את מערכת כניסת העירוי המחברת צינור לדקנטר ארלנמאייר מלא PBS-/-. חבר מחט 23 G לקצה צינור העירוי. פתח את כניסת העירוי ותן ל- PBS לפעול עד שאין בועות בצינור.
- הכינו את הזכוכית הדו-עינית המצוידת באור.
2. דיור עכברי C57BL/6
- לניתוח תאי מיאלואיד או T מסוג CP (מקלעת כורואידים), השתמשו בארבעה עכברים לכל אחד ואגרו את ארבעת ה-CP (שניים מכל חדר רוחבי, החדר השלישי ו-CP בחדר הרביעי; עבור שמונה עכברים בסך הכל). אי איגום CP טומן בחובו סיכון להיכשל באיתור אוכלוסיות החיסון הנדירות ב-CP בשל השכיחות הנמוכה שלהן.
- תנו לעכברים להתאקלם לפחות 7 ימים לפני כל ניסוי. יש לשמור על העכברים בתנאים נטולי פתוגנים בטמפרטורה ולחות קבועות, במחזור אור/חושך של 12/12 שעות או 14/10 שעות, עם מים ומזון כדורי סטנדרטי.
3. זילוח PBS ודיסקציה מוחית
- משקל כל עכבר והזרקת 10 μL/g של תמיסת תערובת הרדמה-משכך כאבים (שלב 1.3) תוך צפקית.
- המתן כ -30 דקות לשיכוך כאבים יעיל (בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת ספרות העכבר).
- מקם את העכבר המרדים שטוח על גבו על תמיכת הדיסקציה והצמד את כפות ידיו לתמיכה בדיסקציה.
- צובטים את עור החיה במלקחיים ומשתמשים במספריים, פותחים את הבטן, הסרעפת ובית החזה כדי לחשוף את הלב.
הערה: כאשר בית החזה נפתח, המוח הופך אנוקסי. יש להתקדם במדויק ובמהירות בשלבים הבאים של הזלוף.
- יש להזריק 20 μL של 100 U/mL תמיסת הפרין ישירות לחדר השמאלי.
- בעזרת מספריים עדינים, בצע חתך של לפחות 3 מ"מ באטריום הימני כדי לאפשר לדם לזרום החוצה מהגוף.
- מיד לאחר מכן, הכנס את מחט 23 G ממוקם בקצה של צינור עירוי דרך קצה החדר השמאלי.
- פתח את מערכת העירוי במקסימום והמתן לזילוח מלא: באמצעות מחט 23 G בקצב זרימה של כ 6 מ"ל / דקה, הזילוח הושלם תוך 3 דקות.
הערה: שינוי הצבע האחיד של איברים כמו הכבד מעיד על יעילות הזלוף.
- סגור את מערכת העירוי והסר את המחט מחדר הלב.
- הסר את הקלטת מכפות הידיים של העכבר. מקם את העכבר במצב גחון.
- צובטים את עור החיה במלקחיים ובעזרת מספריים, מסירים את העור מראש הראש, מהעיניים ועד האוזניים.
- בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת תחילה בין העיניים ולאחר מכן לרוחב מכל עין אל חוט השדרה ממש מעל שרירי המסה. לשם כך, להשתמש בגפיים של מספריים ולהמשיך בעדינות כדי למנוע נזק למוח עם מספריים.
- פתח את הגולגולת עם מלקחיים על ידי צביטה שלה מן הגפיים בין העיניים.
- השתמשו במספריים כדי לחתוך את חוט השדרה ולחלץ את המוח בעזרת מלקחיים, הניחו את שתי הנקודות שלהם בצד הצדדי של המוח כדי להטות אותו והניחו אותו בצלוחית פטרי מלאה ב-PBS+/+ קרים כקרח. לאחר מכן ה- CPs נאספים באופן מיידי.
הערה: בדוק אם יש שינוי צבע במוח כדי לאמת את יעילות הזילוח.
4. דיסקציה של מקלעת הכורואיד מהמוח
- מקמו את הצד הגבי של המוח כלפי מעלה בצלחת הפטרי ומתחת למטרות של זכוכית מגדלת דו-עינית.
- בעזרת מלקחיים כדי לשמור על המוח במקום, הכנס את שני הקצוות של מלקחיים אחרים למטה דרך קו האמצע בין ההמיספרות.
- השתמש במלקחיים כדי למשוך את קליפת המוח עם הקלוסום וההיפוקמפוס הרחק מהמחיצה, לחשוף את החדר הצידי וחלק מהחדר השלישי.
- זהו את ה-CP הצידי כצעיף ארוך המצפה את החדר הצידי המתלקח בשני קצותיו. השתמש בשני הקצוות של מלקחיים דקים כדי לתפוס את CP לרוחב. היזהר לאסוף את החלק האחורי המשולש שעשוי להיות מוסתר על ידי הקפל האחורי של ההיפוקמפוס.
- משכו את קליפת המוח, כפיס המוח וההיפוקמפוס של ההמיספרה הנגדית מהמחיצה כדי לחשוף את כל החדר השלישי ואת החדר הצידי הנגדי.
- לאסוף את CP השלישי עם מלקחיים עדינים, אשר ניתן לזהות כמבנה קצר עם היבט פני השטח גרגירי.
- לאסוף את CP לרוחב השני.
- הכנס את שני הקצוות של מלקחיים למטה בין המוח הקטן למוח האמצעי. נתקו את המוח הקטן מהפונס והמדולה כדי לחשוף את החדר הרביעי.
- זהה את ה-CP הרביעי כמבנה כדורי ארוך עם אספקט פני שטח גרגירי המרפד את החדר הרביעי מהקצה הימני הצידי לקצה השמאלי בין המוח הקטן למדולה. לאסוף את CP הרביעי עם מלקחיים עדינים.
הערה: ציפוי בסיס סילאן של מלקחיים עשוי למנוע דביקות של CP על מלקחיים.
- חזור על שלבים 3.1-4.9 עבור כל אחד משבעת העכברים האחרים. בינתיים, CP שנאסף יכול להישמר באופן זמני בצינור מונח על קרח.
5. הכנת דגימות לניתוח ציטומטריית זרימה
- מלא את הצינור המכיל את כל CP מנותח ל 750 μL של PBS+/+.
הערה: התצהיר של CP מנותח עם מלקחיים דקים בצינור מייצר נפח קטן של PBS+/+. כדי למנוע אובדן אפשרי של רקמת CP, עדיף להשלים את הנפח הקיים ל 750 μL מאשר להסיר ולהחליף אותו עם 750 μL טרי של PBS + / +.
- הוסף 15 μL של 20 U/μL Collagenase IV תמיסת מלאי (ראה שלב 1.2) לקבלת ריכוז סופי של 400 U/mL.
הערה: DNAse I (150 מיקרוגרם/מ"ל) עשוי למנוע הצטברות יתר של תאים.
- יש לדגור CP עם Collagenase IV בטמפרטורה של 37°C תחת תסיסה קלה (300 סל"ד) למשך 45 דקות.
- פיפטה בעדינות למעלה ולמטה סביב 10 פעמים כדי לסיים את הדיסוציאציה CP.
- מלא את צינור ה-CP עד 1.5 מ"ל במאגר MACS (ראה מתכון שלב 1.1) כדי להפסיק את פעילות collagenase IV.
הערה: פעילות Collagenase IV נעצרת בטמפרטורות נמוכות ומעוכבת על ידי אלבומין בסרום.
- צנטריפוגה את התאים ב 500 x גרם, במשך 5 דקות, ב 4 ° C. להשליך את supernatant ולשטוף את התאים עם 1.5 מ"ל של מאגר MACS.
- צנטריפוגה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend תאים ב 220 μL של מאגר MACS.