השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

תקציר

מקור: Sarkar, S. et al., בידוד מגנטי CD11b מהיר ומעודן של מיקרוגליה ראשונית עם טוהר ורבגוניות משופרים. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. גידול תרבויות גליה מעורבות

1. ערפו את ראשיהם של גורים בני יום עד יומיים במהירות עם מספריים פעילים בגודל 5.5 אינץ' והניחו את הראשים מיד בצינור של 50 מ"ל על קרח. שים לב כי עריפת ראש זו היא מצב של המתת חסד.
2. במכסה מנוע זרימת אוויר למינרי, בצע חתך קטן בגולגולת ובקרומי המוח באמצעות מספריים ישרים בגודל 4.5 אינץ 'לניתוח מיקרו. מתחילים לחתוך מהקצה הקאודלי לקצה הרוסטרלי (האף). היכנס מתחת לעור באמצעות הפתח שנוצר על ידי עריפת הראש.
   1. לאחר החתך, מקלפים את אחת ההמיספרות הצידה. לאחר מכן השתמשו בזוג פינצטות מעוקלות או מחוברות כדי להסיר את המוח כולו.
3. טבלו את המוח(ים) בצינור חדש של 50 מ"ל המכיל 0.25% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) למשך 15 דקות באמבט מים של 37°C. השתמש 2 מ"ל של טריפסין-EDTA לכל המוח.
4. שטפו את המוח(ים) במצע גדילה טרי (סרום בקר עוברי 10% (FBS), תערובת נשר מדיום/מזין F12 (DMEM/F12) של Dulbecco, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 1% נתרן פירובט ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות) על ידי הוספה והסרה של המדיה. חזור על פעולה זו 4x.
5. עבור כל מוח, צלחת שתי צלוחיות T-75 המכילות מצע גדילה. לכן, להוסיף 2 מ"ל של מדיה צמיחה לכל המוח לצינור. לכן, זה יהיה שווה ערך של 1 מ"ל של מוח הומוגני עם 8-9 מ"ל של מדיה צמיחה לכל צלוחיות T-75.
6. הומוגניזציה על ידי טריטוציה של המוח(ים) עם פיפטות בגדלים שונים של צמצם, על מנת מהגדול ביותר לקטן ביותר. כאשר נראה כי רקמת המוח אינה נעשית קטנה יותר, עבור פיפטה הבאה. בסוף הטריטורציה, המתלים צריכים להיות ברורים, ללא נתחים נראים לעין.
   1. השתמש פיפטה 25 מ"ל, פיפטה 5 מ"ל, ולאחר מכן פיפטה 10 מ"ל ברצף.
7. העבירו כל תרחיף מוח הומוגני דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להפוך אותו לתרבית תא יחידה.
8. עבור כל מוח הומוגני, לוחית שתי צלוחיות T-75 המכילות מצע גדילה, כמתואר בשלב 1.5 (1 מ"ל של מוח הומוגני עם 8-9 מ"ל של מצע גדילה לכל צלוחיות T-75).
9. לשנות את מצע הצמיחה לאחר 6 ד 'ולגדול עד בידוד ביום ה^-16.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12 (1:1) (1x)	לייף טכנולוגיות	11330057
נתרן פירובט	לייף טכנולוגיות	11360070
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (100x)	לייף טכנולוגיות	11140050
ל-גלוטמין (100x)	לייף טכנולוגיות	25030081
EDTA	פישר סיינטיפיק	AM9260G
סרום בקר עוברי	סיגמא	13H469
0.25% טריפסין-EDTA	Gibco מבית Life Technologies	25200