$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. התמיינות מיקרוגליה
הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מסוכמת באיור 1.
- תרבית תאי גזע פלוריפוטנטית מושרית (iPSC)
הערה: פרטים נוספים המתארים טכניקות תרבות iPSC ניתן למצוא במקום אחר.
- הפשרה ותחזוקה
- הכינו את המדיום iPSC, aliquot אותו, ואחסנו אותו ב -20 °C עד 6 חודשים. הפשירו את האליציטוטים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם עד שבוע. יש להשאיר את המדיה בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
- מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל של למינין 521 מדולל במי מלח חוצצים פוספט של דולבקו (DPBS) המכיל סידן ומגנזיום. שמור את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לפחות 2 שעות או עדיף לילה. לאחר דילול, לאחסן את laminin ב 4 °C במשך 3 חודשים.
- הכינו 10 mM Rho kinase inhibitor Y27632 (ROCK Inhibitor) תמיסת מלאי על ידי דילול במים סטריליים. הפוך aliquots חד פעמי של פתרון מעכב ROCK ולאחסן אותם ב -20 ° C עד 1 שנה.
- הכן 0.5 mM Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) על ידי דילול תמיסת המלאי של 0.5 M EDTA ב- DPBS.
- כדי להפשיר בקבוקון של iPSCs קפואים, הניחו את הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מופשר ברובו. מיד להעביר את התוכן של בקבוקון 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל 4 מ"ל של מדיום iPSC. צנטריפוגה ב 500 × גרם למשך 1 דקה.
- שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים על ידי הוספה איטית של 1 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר כנגד דופן הצינור כדי למנוע הפרעה למושבות.
- הוסף 1.5 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב סלע 10 מיקרומטר לכל אחת מהבארות המצופות והעבר את המושבות המרחפות טיפה אחר טיפה לבארות המכילות את המדיום.
הערה: יש להשתמש ב-5-7 טיפות משלב 1.1.1.6 לתחזוקת תרבית, אך להתאים את צפיפות הזריעה האופטימלית לכל קו iPSC.
- פיזור שווה של התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מקם את התאים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. למחרת, החלף לחלוטין את המדיום על ידי הוספת מדיום iPSC טרי ללא מעכב ROCK.
- לתחזוקה, לשנות את המדיום כל יום עד שהתאים מגיעים 80% מפגש.
הערה: ניתן לשמור על התאים מבלי לשנות את המדיום במשך יומיים אם מדיום iPSC המשמש מאפשר לוח זמנים גמיש להאכלה. מומלץ להגביל זאת לפעם אחת בכל מעבר ורק אם התאים פחות מ-50% נפגשים.
- פיצול
- שואפים את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DPBS (ללא סידן ומגנזיום).
- כדי לעקור את התאים, מוסיפים 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA ודגרים במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר עד ששולי מושבות התאים מתרוממים מפני השטח של הבאר. לשטוף את התאים שוב עם DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום iPSC.
- נתקו את מושבות התאים על ידי גירוד עדין שלהן באמצעות מרים תאים. לגרד כל אזור של הבאר רק פעם אחת כדי למנוע הפרעה למושבות.
הערה: שיטות חלופיות לעקירת המושבות מהבאר ניתן למצוא במקומות אחרים.
- באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל, אוספים את התאים ומעבירים אותם טיפה אחר טיפה ביחס של 1:6 (תאים לבינוניים) לתוך בארות מצופות מראש (כאמור בשלב 1.1.1.2) המכילות 1.5 מ"ל של תווך iPSC.
2. התמיינות iPSC לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs)
הערה: המולקולות הקטנות וגורמי הגדילה מומסים באלבומין בסרום בקר מסונן סטרילי 0.1% ב-DPBS לריכוז מלאי הגבוה פי 1,000 מהריכוז הסופי. מומלץ להבדיל iPSCs לתוך iMGs במהלך מעברים מוקדמים. מומלץ לבצע קריוטיפ שגרתי של קווי iPSC.
- הכנת תמיסת ציפוי סטנדרטית
- הפשירו את תמיסת המלאי של מגיב ציפוי מטריצה חוץ-תאי על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
- Prechill microcentrifuge צינורות מסנן קצוות פיפטה ב 4 ° C.
- Aliquot 250 μL של מגיב ציפוי מטריצה תאית מרוכז לתוך כל צינור מיד להניח על קרח. אחסן את aliquots ב -20 °C.
- כדי להכין את תמיסת הציפוי, הפשירו את אחד מגיבי הציפוי החוץ-תאיים על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
- הוסף 50 מ"ל של תערובת F12 (DMEM-F12) של Dulbecco המותאמת לגידול של תאי גזע עובריים ומושרים אנושיים (המכונים DMEM-F12) לצינור חרוטי מקורר מראש ושמור אותו על קרח.
- מצננים קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל על ידי הדבקת DMEM-F12 קר כקרח מעלה ומטה מספר פעמים, ולאחר מכן מיד משתמשים בקצה פיפטה כדי להעביר 250 μL של מגיב ציפוי המטריצה החוץ תאי לתוך הצינור החרוטי המכיל את תווך DMEM-F12.
הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הציפוי הסטנדרטית למשך שבועיים בטמפרטורה של 4°C.
- היווצרות גוף עוברי (EB)
- הכינו מדיום EB שניתן לשמור עליו בטמפרטורה של 4°C למשך עד 4 ימים.
- ברגע שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%, נתקו את המושבות על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של DPBS והוספת 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה למשך 2 דקות ב-37°C. עקרו את המושבות באמצעות מרים תאים על ידי גירוד מספר פעמים ליצירת מתלה חד-תאי. לאסוף את התאים ולהעביר הכל לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של DPBS.
- צנטריפוגות את התאים ב 500 × גרם במשך 1 דקה, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום EB. קח 10 μL של תאים ודלל 1: 1 עם Trypan כחול. ספרו את התאים עם המאציטומטר, ובהתבסס על ספירת התאים, דללו את מלאי התאים עד לדילול סופי של 10,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר. עבור תאי ציפוי, להוסיף 100 μL של תאים מדוללים לכל באר לתוך היצמדות נמוכה, תחתית עגולה, 96-well plate.
הערה: באופן כללי, ניתן להשיג 48 בארות של צלחת 96 בארות מכל באר 80% של iPSCs.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 125 × גרם במשך 3 דקות לדגור ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 4 ימים. בצע שינוי חצי בינוני ביום השני באמצעות פיפטה רב ערוצית ואיסוף עדין של 50 μL של מדיום ישן, ולאחר מכן להוסיף בחזרה 50 μL של מדיום EB טרי.
הערה: ביום הרביעי, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ייצרו מבנים תאיים כדוריים המכונים EBs כמתואר בסעיף התוצאות. ניתן להאריך את תהליך הבידול EB עד 7 ימים, במידת הצורך.
- יצירת מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)
- הכינו PMP בסיס בינוני, סטרילי-פילטר, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד.
- מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריגל קרה כקרח ודגרים ב 37 ° C ו 5% CO2 לפחות 2 שעות או עדיף לילה.
- ביום הרביעי של התמיינות EB, העבירו את ה-EBs לבארות מצופות המטריגל על ידי איסוף ה-EBs עם קצות פיפטה של 1 מ"ל (באמצעות פיפטה). פיפטה למעלה ולמטה פעם או פעמיים כדי לעקור את EBs מן הבאר. החזיקו את צלחת 6 הקידוחים בזווית מוטה כדי לאפשר ל-EBs להתיישב בקצה הבאר.
הערה: ניתן לצפות תשעה או עשרה EBs לכל ציפוי היטב.
- לאחר שכל ה- EBs התיישבו, פיפטה עדינה ולהסיר את המדיום הישן באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל תוך שמירה על EBs בקצה הבאר. הוסף 3 מ"ל של PMP טרי מוכן בינוני מלא לכל באר. פיזור שווה של התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
- אין להפריע לצלחת במשך 7 ימים כדי לאפשר ל-EBs להיצמד לתחתית הבאר. לאחר זמן זה, בצע שינוי חצי בינוני באמצעות PMP מדיום מלא.
הערה: בשלב זה, רוב EBs צריך להיות מחובר לצלחת. ניתן להסיר כל EBs צפים.
- לאחר 5-7 ימים, בדוק את EBs תחת מיקרוסקופ שדה אור בהגדלה פי 4 כדי לוודא שהם מחוברים לתחתית הבארות. שנה את המדיום כמתואר ב- 1.2.3.5. ביום ה-21, בצע שינוי בינוני מלא עם 3 מ"ל של PMP מדיום מלא.
הערה: אבות מיאלואידים צפים בתווך עשויים להיות ברורים בשלב זה. תאים אלה יש להשליך במהלך השינוי המדיום.
- ביום ה-28, חפשו תאים עגולים המכונים PMPs בסופרנאטנט ואספו את התווך המכיל את ה-PMPs באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ופיפטור אוטומטי. היזהר לא להפריע EBs. העבר את PMPs ואת המדיום לצינור חרוטי של 15 מ"ל והמשך כמתואר בשלב 1.2.4.
הערה: בדרך כלל ניתן לאסוף PMPs מאותו קו iPSC מחמש בארות של צלחת 6 בארות ולאגד יחד בצינור חרוטי יחיד של 15 מ"ל.
- הוסף 3 מ"ל של PMP טרי מדיום שלם לתחזוקה נוספת של EBs. מכיוון ש-PMPs יוצאים ברציפות מ-EBs במשך יותר מ-3 חודשים, אספו אותם כל 4-7 ימים (אל תאפשרו למדיום לשנות את צבעו לגוון צהוב) כמתואר בשלבים 1.2.3.7 ו-1.2.3.8.
הערה: למרות PMPs ניתן לאסוף במשך מספר חודשים, הם עשויים לשנות את הפנוטיפ שלהם עם הזמן.
- בידול ל- iMGs
- הכינו מדיום בסיס iMG (טבלת חומרים), סטרילי-פילטר ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות.
- לאחר שה-PMPs נאספו לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל, צנטריפוגו אותם ב-200 × גרם למשך 4 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-PMPs באמצעות 1-2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG. לספור את התאים באמצעות hemocytometer על ידי לקיחת aliquot קטן דילול 1: 1 עם Trypan blue.
הערה: 0.5-1.5 × 106 PMPs מתקבלים בדרך כלל מדי שבוע, בהתאם לקו iPSC ולגיל תרבות EB.
- צנטריפוגה את שאר התאים שוב ב 200 × גרם במשך 4 דקות. לדלל את PMPs לריכוז הרצוי כך תאים מצופים בצפיפות של ~ 105/cm2 על לוחות שטופלו בתרבית תאים באמצעות iMG שלם טרי שהוכן. בצע שינוי חצי בינוני באמצעות iMG Complete Medium טרי שהוכן כל 3-4 ימים במשך 10-12 ימים כדי לאפשר בידול טרמינלי.
הערה: בשלב זה, התאים צריכים לרכוש מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה. כדי לאשר את המחויבות של PMPs לגורל מיקרוגליה, ניתוח immunofluorescence מבוצע כדי לאשש את הביטוי של סמנים מועשרים מיקרוגליה כגון קולטן purinergic P2RY12 וחלבון transmembrane 119 (TMEM119).
- כדי לשמור על בריאות התאים ועל יכולת הקיום שלהם, בצע את כל הניסויים בין הימים 10 עד 12 של התמיינות iMG.
