הקמת תרבית תאי גליה מולר המתקבלת מרשתיות עכבר

תקציר

מקור: Kang, S., et al. תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של גליית מורין מולר לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את הרבייה של תאי גליה מולר (MG) שבודדו מרשתיות עכבר. הרשתית מנותקת לתרחיף חד-תאי באמצעות אנזימי עיכול. לאחר מכן מגדלים תאים בתווך עם גורם גדילה המקדם התרבות תאי MG ותמותת תאים עצביים. תאי עצב מתים מוסרים תוך כדי מעבר, ותאי MG גדלים לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כתב ויתור: כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. דיסוציאציה ברשתית

הערה: כל השלבים הבאים (עד קצירת תאים) צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית A2 או B2 (BSC).

1. הכינו את תערובת הדיסוציאציה Papain/DNase I באופן הבא.
   1. עבור שש רשתיות, להוסיף 75 μL של DNase I לתוך הצינור המכיל 750 μL של פפאין ולערבב בזהירות (תערובת דיסוציאציה).
   2. להכנת דגימה בודדת הנדרשת לפרוטוקול זה, פצל את הנפח הכולל של 825 μL לשלושה aliquots: 275 μL של התערובת בצינור אחד של 1.5 מ"ל לכל עכבר (שתי רשתיות). חשב את הכמויות הנדרשות של DNase I ו- Papain בהתאם.
      הערה: ניתן לנתק עד שש רשתיות בצינור אחד של תערובת פפאין/DNase I. עם זאת, הכנת דגימה בודדת מביאה לפחות גושים ולצמיחת תאים טובה יותר מאשר דגימות משולבות.
2. מעבירים שתי רשתיות לתערובת דיסוציאציה של פפאין/DNase I. השתמשו בפיפטת העברה בקוטר קצה מוגדל, הרימו את הרשתיות, המתינו עד שהרשתית תשקע בתחתית הקצה, ואז שחררו את הרשתית ללא תמיסת מלח מאוזנת מוגזמת של הנקס (HBSS) לתוך הצינור המכיל תערובת פפאין/DNase I.
3. מניחים על אגוז ודגרים עליו במשך 10 דקות באינקובטור תרבית תאים (37°C, 5% CO₂).
4. לנתק את התאים על ידי pipeting בזהירות למעלה ולמטה (כ 20-30 פעמים) עם פיפטה 1 מ"ל. לאחר ניתוק התאים (כלומר, יצירת תמיסה הומוגנית ללא גושים), הוסיפו 275 μL של מעכב פרוטאז Ovomucoid מערכת הדיסוציאציה Papain כדי לנטרל את הפפאין. מערבבים בעדינות על ידי פיטינג למעלה ולמטה. הערה: אם שש רשתיות נותקו בתערובת 825 μL של פפאין/DNase I, נדרש 825 μL של Ovomucoid.
5. צנטריפוגה את התערובת ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
6. הוסף גורם גדילה אפידרמיס (EGF, 1 μL לכל 1 מ"ל של מדיום הגידול, reconstructed ב 200 מיקרוגרם / מ"ל PBS) לנפח המחושב של מדיום הגידול (1 מ"ל לעכבר) שחומם מראש ב 37 ° C.
   הערה: בהתאם לתכנון הניסוי, ניתן להוסיף את סמן ההתפשטות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), כמו גם 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) או גורמים נדרשים אחרים בתחילת תקופת התרבית.
7. מוציאים את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה. אין לגעת בגלולה שבתחתית הצינור.
8. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות ובשלמות. השהה מחדש את גלולת התא עם 500 μL של מדיום גידול בתוספת EGF.
9. העבירו את תרחיף התא לבאר אחת של צלחת 12 הקידוחים המסומנת (איור 1C). שוטפים את הצינור עם עוד 500 μL של מדיום הגידול בתוספת EGF ומוסיפים אותו לבאר (נפח כולל של 1 מ"ל לכל באר).
10. חזור על שלבים 1.8 ו- 1.9 עם כל שאר הדגימות.
11. נענעו את צלחת הבאר שלוש פעמים בזהירות (קדימה ואחורה; שמאלה וימינה). מניחים את הצלחת לתוך האינקובטור (37 ° C, CO₂).
    הערה: אם משתמשים בעכברים טרנסגניים, בצעו גנוטיפ עבור כל חיה (איור 1D). זהה עכברי Cre recombinase חיוביים ושליליים ותייג את הצלחת בהתאם. עבור פרוטוקול זה, רק תאים של עכברי כתב חיובי Cre recombinase שימשו לשלבים הבאים. תאים של דגימות שליליות של Cre מוקפאים ומשמשים ליישומים אחרים.

2. שלב הצמיחה

הערה: שלב הצמיחה נמשך כ-4-5 ימים (איור 2B). לצורך הוספת נוזלים לבארות המכילות תאים, פיפטה צריכה להצביע על דופן הבאר והנוזל צריך להשתחרר לאט כדי למנוע ניתוק תאים. אין לבצע פיפטה ישירות על גבי התאים.

1. יום לאחר הדיסוציאציה, יש להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום גידול טרי בתוספת EGF.
2. ביום השלישי, הסירו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל HBSS (טמפרטורת החדר) כדי להסיר פסולת תאים. התנדנדו בעדינות קדימה ואחורה משמאל לימין. הסירו HBSS, חזרו על שלב השטיפה והוסיפו 1 מ"ל של מדיום גידול שחומם מראש בתוספת EGF.
3. עקוב אחר התאים מדי יום והערך את מצב הצמיחה שלהם עד שהתאים מגיעים למפגש של 90%-100%. איור 3 מראה דוגמה לצמיחה טובה של MG לאורך זמן. בדוק זיהום אפשרי או מוות תאי. השליכו תרביות מזוהמות.
   הערה: כדי לנטר ולהקליט את מצב התא, צלם תמונות בהגדלות שונות באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה מחוברת ומטרות 4x, 10x או 20x. במחקר זה נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. הכנת כיסויים עם מעיל פולי-L-אורניתין (Poly-O) ולמינין

הערה: שלב זה נחוץ רק אם מבוצעים תיוג אימונופלואורסצנטי ומיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. כיסויי זכוכית עגולים (בקוטר 12 מ"מ) נדרשים להדמיה נכונה. פרוטוקול הציפוי נמצא גם בגיליון הנתונים של התווך העצבי (ראה טבלת חומרים).

1. הניחו בזהירות כיסויים סטריליים במרכז כל באר של צלחת בת 24 בארות באמצעות מלקחיים סטריליים של Dumont #2AP.
   הערה: מניחים כיסויים במרכז הבאר. הצבת כיסויים קרוב לקיר של באר תגרום לבעיות מתח פני השטח בשלבים הבאים.
2. הפשירו אליקוט פולי-O בנפח 2.5 מ"ל בטמפרטורת החדר והניחו 100 מיקרוליטר ממנו במרכז כל כיסוי.
3. דוגרים על צלחת הבאר במשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
4. הסר את Poly-O ושטוף את הבאר עם הכיסוי שלוש פעמים עם ~ 1 מ"ל של מים סטריליים.
5. תנו לצלחת הבאר להתייבש למשך הלילה ב-BSC. להפשיר 2.5 מ"ל של Laminin ב 4 °C (75 °F) בן לילה.
6. למחרת בבוקר, להוסיף 100 μL של Laminin במרכז כל כיסוי לדגור במשך 4 שעות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
7. מוציאים את הלמינין בזהירות ובשלמות.
8. שמור את הצלחת על 4 ° C אם המעבר לא ניתן לבצע מיד.
   הערה: את הכיסויים המצופים בצלחות מוכנות ניתן לשמור במשך כמה ימים ב 4 ° C.

4. מעבר תאים להסרת ניצולים עצביים

הערה: מעבר תאים נדרש כדי להסיר תאים עצביים, לא כדי להגדיל את אוכלוסיית התא. גליה מתחלקת רק כמה פעמים ולא תגדל עוד יותר לאחר המעבר. אין לדלל את מתלי התאים. התאים של באר מפגש אחת של צלחת בת 12 בארות יכולים להיות מופצים על באר אחת של צלחת בת 12 בארות או על שתי בארות של צלחת בת 24 בארות. כאשר משתמשים בכיסויים מצופים, רק כשליש מהכיסויים מצופים. לכן, שישה כיסויים היושבים בצלחת של 24 בארות, עם תאים מתלכדים (~80%-90%) ניתן לקבל מבאר אחת של תאים מתמזגים של צלחת בת 12 בארות. ניתן לבחור יחסים אחרים כדי להגדיל או להקטין את צפיפות התא גם כן. עבור פרוטוקול זה, עכבר כתב Cre+ אחד משמש [ניסוי אחד, שני טיפולים: miR-25 או control-miR; טכני משכפל n = 3 (שלושה coverslips לכל טיפול), ביולוגי replicate n = 1]. ניתן להגדיר את מספר העותקים הטכניים והביולוגיים באופן שונה בהתאם לתכנון הניסוי.

1. בדוק אם התאים הם 90%-100% confluent (גם בשולי הבאר; איור 3E,F).
2. הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של HBSS (טמפרטורת החדר) לשטיפה. נענעו בעדינות את הצלחת (קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה). הסר את HBSS לחלוטין.
3. הוסיפו 500 μL של תמיסה המכילה טריפסין שחוממה מראש (מחוממת מראש ב-37°C באמבט חרוזי מתכת) כדי לנתק את התאים מהבאר. רוקדים בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין) ודגרים במשך 2 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
4. העבר את הצלחת מהאינקובטור ל- BSC. תוך כדי הטיה, שאפו את התמיסה המכילה טריפסין ופזרו אותה בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין. החזיקו את הצלחת כנגד האור וודאו שלא נותרו תאים בתחתית.
5. העבר את תרחיף התא הזה לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C.
6. הסר את supernatant בזהירות resuspend את גלולת התא על ידי הוספת 600 μL (100 μL לכל באר עבור 6 בארות / מכסה) של מדיום גידול מחומם מראש (בתוספת EGF; 1:1000). ו pipetting למעלה ולמטה ~ 30-40 פעמים.
   הערה: ניתן להקפיא את התאים בשלב זה בטמפרטורה של -80°C או בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים להפשרת קווי תאים. אם תאים מוקפאים, הם לא יושהו מחדש בתווך בתוספת EGF (מדיום צמיחה). הם יושהו מחדש בתווך בסיסי (ללא EGF) ותמיסת הקפאה (יחס של 1/1).
7. תאי זרע על ידי הנחת 100 μL של 600 μL תא / תרחיף מדיה במרכז שישה כיסויים מצופים (ראה שלב 5) של צלחת 24 בארות. מניחים את הצלחת בזהירות באינקובטור ונותנים לתאים להתיישב.
   הערה: 100 μL של תרחיף תאים של 600 μL (שנקצר מבאר אחת של צלחת בת 12 בארות) יגרום למפגש תאים של 90%-100%, הנדרש לטרנספקציה.
8. בדוק את התאים לאחר 3 שעות כדי לראות אם הם התיישבו על הכיסוי. הוסף 400 μL של מדיום צמיחה בתוספת EGF.
   הערה: תאים בדרך כלל מוכנים להתמרה למחרת (איור 3G). אם הם לא שוטפים (90%-100%), השאירו אותם ליום אחר. אם עדיין לא מתמזגים, אל תשתמש בהם להעברה. אם מתבצעים יישומים אחרים במורד הזרם, כגון פרופיל miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR או כתם מערבי, יש להעביר תאים ללוחות של 12 בארות (יחס של 1:1; אין צורך בטיפול בצלחות) ולקצור אותם לצורך מיצוי RNA/חלבון.

תוצאות

איור 1: דיסוציאציה רשתית וגנוטיפ. (A) גביע עיניים עם קרנית, עדשה, קשתית וזגוגית שהוסרו. (B) רשתיות מבודדות; תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) מוסרים לאחר שטיפה יסודית. (C) צלחת בת 12 בארות עם רשתיות מנותקות (שתי רשתיות לכל באר). (D) חיתוך של דוגמה לתמונת ג'ל גנוטיפ. גנוטיפ נדרש כדי לזהות את העכברים שיש להם ביטוי מונע Ascl1 Cre recombinase וישמש למעקב אחר המרת תאים. פסי קנה מידה: 1 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חיות
עכבר Ascl1-CreERT Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	מעבדות Jax	#012882	עכברי Ascl1-CreERT הוצלבו עם עכברי tdTomato
tdTomato-STOPfl/fl עכבר B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	מעבדות Jax	#007914	גנוטיפ נדרש כדי לזהות עכברים חיוביים Ascl1CreER
ריאגנטים
פולי-L-אורניתין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P4538-50MG	נבנה מחדש במים מעוקרים, aliquots קפואים
תוספת N-2	פישר סיינטיפיק	17-502-048	Aliquots קפואים
מדיום נוירובזלי	פישר סיינטיפיק	21-103-049	משמש למדיום גידול בסעיף 1.1, יש לאחסן ב-4°C
מערכת דיסוציאציה פפאין	וורת'ינגטון ביוכימיה	LK003153	נוצר מחדש בתמיסת מלח מאוזנת של ארל, אליציטוטים קפואים
פניצילין סטרפטומיצין	פישר סיינטיפיק	15-140-122	Aliquots קפואים
ל-גלוטמין	פישר סיינטיפיק	25-030-081	Aliquots קפואים
HBSS	פישר סיינטיפיק	14-025-134	יש לאחסן ב-4°C
סרום בקר עוברי (FBS)	פישר סיינטיפיק	MT35010CV	Aliquots קפואים
כלי פלסטיק/חומרים מתכלים
0.6 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	50-408-120
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	50-408-129
10 μL TIP מסנן סטרילי טיפים פיפטה	פישר סיינטיפיק	02-707-439
100 μL TIP מסנן סטרילי טיפים פיפטה	פישר סיינטיפיק	02-707-431
1000 μL TIP מסנן סטרילי טיפים פיפטה	פישר סיינטיפיק	02-707-404
2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	50-408-138
20 μL TIP מסנן סטרילי טיפים פיפטה	פישר סיינטיפיק	02-707-432
פיפטות בנפח מתכוונן (2.5, 10, 20, 100, 200 ו-1000 μL)	אפנדורף	2231300008
פייפטי העברה חד פעמיים	פישר סיינטיפיק	13-669-12
לוחות שטוחים מרובי בארות עם מכסים, מס' של בארות = 12	פישר סיינטיפיק	08-772-29
לוחות שטוחים מרובי בארות עם מכסים, מס' של בארות = 24	פישר סיינטיפיק	08-772-1
פילטר סטרילי PIPET 10ML פילטרים סרולוגיים חד פעמיים	פישר סיינטיפיק	13-676-10J
פילטר סטרילי PIPET 50 מ"ל פילטרים סרולוגיים חד פעמיים	פישר סיינטיפיק	13-676-10Q
פילטר סטרילי PIPET 5ML פייפטים סרולוגיים חד פעמיים	פישר סיינטיפיק	13-676-10 שעות
כפפות מבחן ניטריל ללא אבקה	פישר סיינטיפיק	19-130-1597ב
כיסויים עגולים (קוטר 12 מ"מ, עובי 0.17 - 0.25 מ"מ)	פישר סיינטיפיק	22293232
מסנן ואקום, גודל נקבוביות = 0.22 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	09-761-106
ציוד
ארון בטיחות ביולוגית 1300 B2	תרמו סיינטיפיק	1310
מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One Keyence BZ-X 810	קיינס	9011800000
מיקרוסקופ סטריאו זום דו-עיני	חזון מדעי	VS-1EZ-IFR07
צלחות פטרי חד פעמיות (קוטר 100 מ"מ)	VWR	25384-088
Dumont #5 מלקחיים - ביולוגיה/טיטניום	כלים מדעיים משובחים	11252-40
Dumont #55 מלקחיים - Biologie/Inox	כלים מדעיים משובחים	11255-20
Dumont #7 מלקחיים מעוקלים - Biologie/טיטניום	כלים מדעיים משובחים	11272-40
Eppendorf צנטריפוגה 5430 R	אפנדורף	2231000508
אינקובטור CO2 עם מעיל מים	VWR	10810-744