$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת חיץ
הערה: אם אתם מבצעים ריצוף RNA במורד הזרם, טפלו ביסודיות בכל סביבות העבודה והכלים עם תמיסת טיהור RNase כדי למנוע התפרקות mRNA.
- הכינו חיץ ליזיס.
- ממיסים את הדברים הבאים במים מזוקקים (H2O) עד 50 מ"ל: 5.47 גרם סוכרוז (0.32 מ' סופי), 250 מיקרוליטר של 1 מ' סידן כלורי (CaCl2) (5 מ"מ סופי), 150 מיקרוליטר של 1 מ' מגנזיום אצטט (מ"ג (CH3COO)2 (3 מ"מ סופי), 10 מיקרוליטר של 500 מ"מ חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) (0.1 מ"מ סופי), 500 μL של 1 M Tris-hydrochloric acid (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM סופי), 50 μL של Triton X-100 (0.1% סופי), ו-17 μL של 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM סופי, הוסף טרי) (ראה טבלת חומרים).
- הכנת חיץ סוכרוז
- יש להמיס את הדברים הבאים ב-H2O מזוקק עד 50 מ"ל: 30.78 גרם סוכרוז (1.8 מ' סופי), 150 מיקרוליטר של 1 מ"ג (CH3COO)2 (3 מ"מ סופי), 500 מיקרוליטר של 1 מ' Tris-HCl (pH 8) (10 מ"מ סופי), 17 מיקרוליטר של 3 מ"מ DTT (1 מ"מ סופי, הוסף טרי).
2. דיסוציאציה של רקמות קפואות לתרחיף של גרעין יחיד
- הוסיפו 4 מ"ל של חיץ ליזיס קר כקרח למטחנה (מטחנה) מזכוכית בנפח 7 מ"ל, ושמרו על קרח. לנתח כ 200-400 מ"ג של קליפת המוח האנושית הבוגרת קפוא טרי, להקפיץ כ 50x, ולהעביר את הרקמה הומוגנט 12 מ"ל צינור פוליפרופילן אולטרה צנטריפוגה.
- באמצעות פיפטה 5 מ"ל, להוסיף 6.5 מ"ל של חיץ סוכרוז קר כקרח לתחתית צינור ultracentrifuge, בזהירות לא להפריע את השכבה בין סוכרוז ואת homogenate הרקמה.
הערה: בעת עיבוד דגימות נוספות, אזן בזהירות את הצינורות לפי משקל על-ידי הוספת חיץ ליזיס נוסף לדגימה הקלה יותר. איזון מדויק של צינורות האולטרה-צנטריפוגות חיוני למניעת נזק לרוטור ולהבטחת סיבוב במהירות הנכונה.
3. אולטרה-צנטריפוגה
- אולטרה-צנטריפוגה של הליזט ב-24,400 סל"ד (101,814 × גרם) למשך שעה אחת ב-4°C. יש לשאוף בזהירות את הסופרנאטנט והפסולת מבלי להפריע לכדור.
הערה: גלולה לא יכולה להיות גלויה אם מתחילים עם פחות מ 200 מ"ג של רקמה.
- יש להוסיף 600 μL של מי מלח חוצצים פוספט (PBS) (סידן (Ca2+), מגנזיום (מ"ג2+) חינם) לגלולת הגרעינים ולדגור על קרח במשך 10 דקות לפני השעיה מחדש.
- פיפטה למעלה ולמטה 50 פעמים כדי להשעות מחדש את גלולת הגרעינים על קרח.
- השתמש בהמוציטומטר כדי לדמיין את הגרעינים השלמים תחת מיקרוסקופ ולהבטיח שריכוז התרחיף יהיה מעל 105 גרעינים / מ"ל לפני שתמשיך לשלב הבא (שלב 10 μL של הגרעינים המרחפים מחדש עם 10 μL של כחול טריפאן).
4. דגירה של נוגדנים
- כדי לתייג את הדגימה למיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FANS), הוסף 500 μL של כדורית הדגימה המושעה, 490 μL של 1x PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), 10 μL של אלבומין 10% בסרום בקר (BSA) (0.1% סופי), 1 μL של נוגדן נגד NeuN עכבר מצומד ל- AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, ריכוז סופי 1:1000), ו-1 μL של נוגדן עכבר נגד PAX6 מצומד לאלופיקוציאנין (PAX6-APC, ריכוז סופי 1:1000).
הערה: ניתן להוסיף נוגדנים חלופיים מצומדים לפלואורופורים אחרים. כאן, עכבר אנטי OLIG2 מצומד AF488 (ריכוז 1:1000) שימש עם תוצאות חיוביות.
- בצע 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בלבד ופקדים בצבע יחיד כדי להגדיר פרמטרים gating, תוך שימוש בכמות קטנה של הדגימה לפי הצורך.
- כדי לבצע בקרת AF555 בצבע יחיד, הוסף 20 μL של גלולת הדגימה המושעה, 970 μL של 1x PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי), ו 1 μL של נוגדן NeuN-AF555 (ריכוז 1:1000).
- כדי לבצע בקרת APC בצבע יחיד, הוסף 20 μL של גלולת הדגימה המושעה, 970 μL של 1X PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי), ו 1 μL של נוגדן PAX6-APC (ריכוז 1:1000).
- כדי לבצע בקרת DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) בלבד, הוסף 20 μL של גלולת הדגימה המושעה, 970 μL של 1X PBS (Ca2+, Mg2+ חינם), ו- 10 μL של 10% BSA (0.1% סופי) (DAPI יתווסף מאוחר יותר, ראה 4.4).
הערה: אם נעשה שימוש ביותר משני נוגדנים, מומלץ לבצע בקרת פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) בנוסף לבקרות בצבע יחיד.
- לדגור את הדגימות ואת הפקדים עם סיבוב בחושך במשך 1 שעה ב 4 ° C.
- הוסף DAPI בשעה 1:1000 לכל הדגימות והפקדים והמשך במיון.