קבלת אוכלוסיות תאים עצביים שונות מהיפוקמפוס של חולדה

תקציר

מקור: Schwarz, J. M. שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנטי כדי לבחון ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא ברקמת מוח חולדה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד תאים מהיפוקמפי חולדה, כולל נוירונים, אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. איסוף רקמות

1. הכינו את Buffer X מערכת הדיסוציאציה העצבית על ידי הוספת בטא-מרקפטואתנול ל-Buffer X לריכוז סופי של 0.067 mM (עבור 4 דגימות, הוסיפו 13.5 μl של 50 mM בטא-מרקפטואתנול ל-10 מ"ל של Buffer X).
2. הכינו את Enzyme Mix 1 על ידי ערבוב 50 μl של אנזים P עם 1,900 μl של Buffer X עבור כל דגימה כמתואר בפרוטוקול של ערכת הדיסוציאציה העצבית לדוגמה, עבור 4 דגימות, ערבבו 200 μl של אנזים P עם 7,600 μl של Buffer X.
3. מקם את Buffer X באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס.
4. מניחים 2 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת קרה של האנק (HBSS) (ללא Ca⁺⁺ ו- Mg⁺⁺) לבאר אחת של צלחת תרבית סטרילית בת 6 בארות עבור כל דגימה שתיאסף ותשמור על קרח לדיסקציה של רקמות.

2. דיסוציאציה עצבית (1 שעות)

1. חתכו כל דגימת רקמה לחתיכות קטנות באמצעות סכיני גילוח סטריליים על מכסה צלחת התרבית בעלת 6 הבארות. פרוטוקול זה שימש לדגימות רקמה של כ 30 - 100 מ"ג, אך מאושר לדגימות רקמה של עד 400 מ"ג. עבור דגימות רקמה גדולות מ 400 מ"ג, נפחי מגיב חייב להיות בקנה מידה מתאים.
2. השתמש 1 מ"ל של HBSS טרי ללא Ca²⁺ ו- Mg²⁺ כדי להעביר את חתיכות הרקמה חתוכות לקוביות עם פיפטה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל. חזור על שלבים 2.1 ו- 2.2 עבור כל הדגימה עד שכל הדגימות יועברו לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
3. צנטריפוגו את הדגימות ב 300 x גרם במשך 2 דקות ב RT ולשאוף supernatant.
4. הוסיפו 1,900 מיקרוליטר של אנזים חם Mix 1, כפי שהוכן בשלבים 1.2 ו-1.3, לכל דגימה וסגרו את הצינורות.
5. לדגור את הדגימות במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, להפוך את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי להשעות מחדש את חתיכות הרקמה התיישבו.
6. בינתיים, הכינו את Enzyme Mix 2 על ידי ערבוב 20 μl של Buffer Y עם 10 μl של אנזים A מופשר (עבור 4 דגימות, ערבבו 80 μl של Buffer Y עם 40 μl של אנזים A מופשר).
7. יש להוסיף 30 μl של Enzyme Mix 2 לכל דגימה ולהפוך בעדינות. אין לערבל.
8. לנתק כל דגימת רקמה עם פיפטה פסטר "1", triturating למעלה ולמטה 30 פעמים.
9. לדגור את הדגימות במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; להפוך את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי להשעות מחדש את חתיכות הרקמה התיישבו.
10. נתקו כל דגימת רקמה עם פיפטה "2" של פסטר, תוך כדי עלייה ומטה 30 פעמים, תוך הימנעות מיצירת בועות.
11. נתקו כל דגימת רקמה עם פיפטה "3" של פסטר, תוך כדי עלייה ומטה 30 פעמים, תוך הימנעות מיצירת בועות.
12. לדגור את הדגימות במשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; להפוך את הצינורות מספר פעמים כל 5 דקות כדי להשעות מחדש את התאים התיישבו.
13. יש למרוח תרחיף חד-תאי על זן תאים של 80 מיקרון המונח על גבי צינור בז של 15 מ"ל כדי להסיר חתיכות גדולות של פסולת ולשטוף את המסנן והתאים עם 10 מ"ל HBSS (עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) כדי לעצור את תגובות האנזים. חזור על הפעולה עד שכל דגימה מועברת לצינור בז נקי של 15 מ"ל.
14. צנטריפוגו את הדגימות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT ולשאוף את supernatant.

3. דלדול מיאלין (45 דקות)

1. ביסודיות להשעות מחדש את גלולת התאים עם 400 μl של חיץ הסרת מיאלין.
2. הוסף כמות מוגדרת של חרוזים להסרת מיאלין ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
   הערה: נפח חרוזי הסרת המיאלין בשימוש יהיה תלוי בגודל הרקמה, בגיל החיה, ואת כמות המיאלין הצפויה באותו אזור מסוים במוח. לדוגמה, עבור דגימת היפוקמפוס של חולדה בוגרת (כ -300 מ"ג), לדגור את הדגימה עם 100 μl של חרוזים להסרת מיאלין.
3. דוגרים במשך 15 דקות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
4. לשטוף כל מדגם עם 5 מ"ל של חיץ הסרת מיאלין.
5. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
6. בעת צנטריפוגת הדגימות, מקם עמודה אחת לכל דגימה בשדה המגנטי של הממיין המגנטי ומקם מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה.
7. הכן את העמודות והסנן על ידי שטיפת כל עמודה עם 1 מ"ל של חיץ להסרת מיאלין שלוש פעמים (3 מ"ל בסך הכל). אסוף את כל הזרימה במיכל פסולת, כגון תחתית של קופסת עצות ריקה.
8. הניחו צינור תחתון עגול מפוליסטירן בנפח 5 מ"ל ישירות מתחת לכל עמודה כהכנה לאיסוף הדגימה.
9. כאשר התאים סיימו את הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט והשעו אותו מחדש ב-500 מיקרוליטר של חיץ להסרת מיאלין. מיד להחיל את השעיית התא על העמודה ולאסוף את התאים בצינור למטה.
10. שטפו את המסנן והעמוד עם חיץ להסרת מיאלין בנפח 1 מ"ל, 4 פעמים (4 מ"ל בסך הכל).
11. צנטריפוגה את אוסף התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
12. שאפו את הסופרנאטנט והתאים מוכנים כעת לצביעה.

4. צביעת תאים חיים עבור FACS (שעה אחת לצביעה)

1. מערבול קצר (2 שניות) את התאים כדי להפריד את הגלולה ומיד להוסיף 5 μl של בלוק Fc (אנטי אשכולות של התמיינות 32, CD32), מערבלים שוב, לדגור במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונית על ידי הוספת שלושת הנוגדנים העיקריים במאגר השטיפה באופן הבא: 0.125 μl של allophycocyanin (APC) - נוגדן CD11b מצומד (1:800), 1 μl של נוגדן נגד GLT1 (1:100), ו 0.4 μl של Fluorescein isothiocyanate (FITC) – נוגדן Thy1 מצומד (1:250) עבור כל 100 μl של חיץ שטיפה. כל דגימה תקבל 100 μl של תערובת נוגדנים ראשונית לדגירה; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ- 400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם
3. הכן צינורות לבקרות צביעה בודדות על ידי הסרת 2 μl בלבד של תאים מכל צינור דגימה והוספתו לכל צינור בקרת כתמים יחיד. פקדי "הכתם היחיד" כוללים: APC-CD11b בלבד, GLT1 בלבד, FITC-Thy1 בלבד, נוגדן PE משני בלבד, והפקד "ריק" או לא מוכתם.
   הערה: כל הדגימות צריכות להיות מיוצגות בכל בקרות הצביעה, ולכן יש להוסיף 2 μl של תאים מכל דגימה לכל צינור בקרת צביעה.
4. מערבלים לזמן קצר את הצינורות (2 שניות) ומוסיפים 100 μl של תערובת נוגדנים ראשונית לכל צינור דגימה ו-100 μl של נוגדן ראשוני מתאים לכל צינור בקרת צביעה, מערבלים שוב את הצינורות, מכסים את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי להגן על הנוגדנים הפלואורסצנטיים מכל אור, ודגרים על הצינורות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הדגימות צריכות להישמר קרירות (ב 4 מעלות צלזיוס) למשך שארית ההליך כדי לשמור על שלמות הדגימות והנוגדנים.
5. מערבלים בקצרה את הצינורות ומוסיפים 2 מ"ל של חיץ כביסה לכל צינור.
6. צינורות צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
7. בינתיים, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית על ידי הוספת 0.2 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד PE נגד ארנב לכל 100 מיקרוליטר של חיץ שטיפה. כל דגימה תקבל 100 μl של תערובת נוגדנים משנית; עם זאת, אם הדגימה שלך גדולה בהרבה מ -400 מ"ג רקמה, ייתכן שתרצה לשקול להגדיל את נפח תערובת הנוגדנים העיקרית שלך בהתאם.
8. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, זרקו את הסופרנאטנט מכל דגימה לכיור והכתימו את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.
9. מערבלים בקצרה את הצינורות ומוסיפים 100 μl של תערובת נוגדנים משנית לכל צינור דגימה ואת הנוגדן המשני המתאים לכל בקרת צביעה. לאחר מכן, מערבלים שוב את הצינורות, מכסים אותם ברדיד אלומיניום ודגרים עליהם במקרר בטמפרטורה של 4ºC למשך 15 דקות.
   הערה: צינור בקרת הצביעה GLT1 בלבד אמור לקבל את תערובת הנוגדנים המשנית.
10. לאחר הדגירה, מערבלים בקצרה את הצינורות ומוסיפים 2 מ"ל של חיץ כביסה לכל צינור.
11. צנטריפוגה את הצינורות ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
12. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, זרקו את הסופרנאטנט מכל דגימה לכיור והכתימו את הצינורות הפוכים על מגבת נייר.
13. מערבלים את הצינורות ומוסיפים 0.25 מ"ל של PBS סטרילי לכל צינור. הדגימות מוכנות למיון.
    הערה: תאים נוספים עשויים לדרוש 0.5 מ"ל של PBS סטרילי; עם זאת, עדיף להתחיל עם נפח נמוך יותר כמו הדגימה תמיד יכול להיות מדולל אם הוא מרוכז מדי עם תאים.
    הערה: לחלופין, הוסף DNase לצינור כדי למנוע מהתאים להתגבש ובכך לסתום את המיון. ניתן גם לסנן דגימות באמצעות מסנן סטרילי של 80 מיקרון ממש לפני המיון כדי למנוע סתימת המיון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת דיסוציאציה עצבית (P)	Miltenyi ביוטק	130-092-628
חרוזים להסרת מיאלין II	Miltenyi ביוטק	130-096-733
עמודות LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401
מפריד QuadroMACS	Miltenyi ביוטק	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi ביוטק	130-042-303
יריעת רשת ניילון	אמזון	CMN-0074-10YD	רוחב 40 אינץ', רשת רשת בגודל 80 מיקרון
בלוק FC / אנטי CD32	BD Biosciences	BDB550270	תגובתיות לחולדה
נוגדן CD11b מצומד APC	ביואגדה	201809	תגובתיות לחולדה
ארנב נגד GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	תגובתיות לחולדה או לאדם
נוגדן משני מצומד PE נגד ארנב	eBioscience	1037259	נוגדן משני לאנטי GLT1
נוגדן עכבר CD90 CD90 (Thy1) מצומד FITC	ביואגדה	202504	תגובתיות לחולדה