1. הכנה ואיסוף של תולעים ישנות לבידוד תאים
- אספו תולעים והכינו מאגרים לבידוד תאים.
- לאסוף תולעים בצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לשטוף תולעים מהצלחת עם 1.5 מ"ל של חיץ M9 (1 מ"מ MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7.0) וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,600 x גרם. יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף תולעים עם 1 מ"ל של חיץ M9. חזור על הצנטריפוגה ושטוף בסך הכל חמש פעמים כדי להסיר זיהום Escherichia coli ככל האפשר.
הערה: הוספת אנטיביוטיקה (50 מיקרוגרם/מ"ל), כגון אמפיצילין, בשלב זה יכולה לסייע בהפחתת זיהום חיידקי .
- עבור שתי דגימות, להכין 2 מ"ל של סודיום דודציל סולפט-dithiothreitol (SDS-DTT) מאגר ליזיס: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה) (pH 8.0), ו 3% (w / v) סוכרוז.
- הכינו 15 מ"ל של חיץ בידוד (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7.3]) ואחסנו אותו על ice.
הערה: גם מאגר הליזה SDS-DTT וגם מאגר הבידוד חייבים להיות טריים לפני כל ניסוי.
- הפרעה בקוטיקולה ובידוד תא בודד
- חיות צנטריפוגות שנאספו בשלב 1.1.1 למשך 5 דקות במהירות של 1,600 x גרם. הסר את כל תולעי העל וההשהיה ב 1 מ"ל של מדיה M9 והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- תולעי גלולה עם צנטריפוגה ב 1,600 x גרם במשך 5 דקות.
- הוסף 200 μL של חיץ ליזיס SDS-DTT לתולעים ודגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תולעים צריכות להיראות "קורצות" לאורך הגוף אם מסתכלים עליהן תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: חשיפה ממושכת לחיץ ליזה SDS-DTT עלולה לגרום למוות של תולעים, אשר ניתן לנטר על ידי התבוננות בתולעים. תולעים מתות יתארכו ולא יתכרבלו.
- יש להוסיף 800 μL של חיץ בידוד קר כקרח ולערבב באמצעות צינור מהבהב בעדינות.
- תולעי גלולה למשך דקה אחת ב 13,000 x גרם ב 4 ° C, להסיר supernatant ולשטוף עם 1 מ"ל של חיץ בידוד.
- חזור על שלב 1.3.5 בסך הכל חמש פעמים, והסר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם.
- הוסף 100 μL של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus (15 מ"ג / מ"ל) (טבלה של חומרים) מומס בחיץ בידוד לגלולה ולדגור במשך 10-15 דקות ב RT.
הערה: בדומה למאגר הליזה SDS-DTT, עיכול פרוטאז ממושך עלול לגרום לפיצול יתר של חלבונים לאורך קרום הפלזמה, ולמנוע בידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שנחשף לפני השטח באמצעות חרוזים מגנטיים.
- במהלך הדגירה עם תערובת פרוטאז, יש למרוח הפרעה מכנית על ידי דגימות צנרת למעלה ולמטה כנגד תחתית צינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרו-ליטר למשך ~60-70 פעמים. שמור את קצה פיפטה על הקיר של צינור microcentrifuge עם לחץ קבוע כדי לנתק כראוי תאים.
- כדי לקבוע את שלב העיכול, הסר נפח קטן (~ 1-5 μL) של תערובת העיכול, זרוק אותו על שקופית זכוכית ובדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות. לאחר 5-7 דקות של דגירה, רסיסי תולעים צריכים להיות מופחתים באופן ניכר לעין ואת slurry של תאים יהיה גלוי בקלות.
- עצור את התגובה עם 900 μL של מדיום L-15 קר זמין מסחרית של לייבוביץ' בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 50 U/mL פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
- גלולה בודדה שברים ותאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x גרם ב 4 ° C. לשטוף את התאים גלולה עם 1 מ"ל של מדיה קרה בתוספת L-15 פעמיים נוספות כדי להבטיח כי עודפי פסולת וקוטיקולה מוסרים.
- יש להשהות מחדש תאים כדוריים ב-1 מ"ל של מדיה בתוספת L-15 ולהשאיר על קרח למשך 30 דקות. קח את השכבה העליונה, בערך 700-800 μL, לצינור מיקרוצנטריפוגה. שכבה זו מכילה תאים ללא פסולת תאים ותשמש לבידוד הבא של תאים מעניינים.
- בהתאם להוראות היצרן, השתמש במונה תאים אוטומטי או בהמוציטומטר כדי למדוד את צפיפות התאים של 10-25 מיקרוליטר של תאים מבודדים.
2. בידוד תאים חיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה
- בידוד תאים חיוביים ל-GFP על ידי ציטומטריית זרימה
- מתרחיף תאים מבודד שנאסף בשלב 1.2.12, תאי צנטריפוגות למשך 5 דקות ב- 10,000 x גרם ב- 4 ° C. יש להשליך סופרנאטנט ולהשהות תאים כדוריים בתווך בתוספת L-15 לצפיפות תאים של לא יותר מ 6 x 106 תאים / מ"ל כדי למנוע עומס יתר על ציטומטר הזרימה.
- מיין תאים לפי ביטוי חיובי GFP באמצעות ציטומטר זרימה המסוגל למיין דגימות. תאים שליליים של GFP יכולים לשמש כבקרה לניתוח ספציפי שאינו סוג תא.
- גידול תאים מבודדים
- צלחת תאים מבודדים לתוך צלחת סטרילית 6-באר רב באר.
הערה: צלחות אלה עשויות להיות מצופות בלקטין בוטנים כדי להגביר את חיבור התא; עם זאת, אם יש להשתמש בתאים באופן מיידי, ניתן להתעלם מצעד זה.
- הניחו את הצלחת במיכל פלסטיק ודגרו על התאים בטמפרטורה של 20°C בעזרת מגבון לח או נייר טישו רך (הוסיפו 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין למים מזוקקים פעמיים [ddH2O] כדי להבטיח שלא תהיה צמיחת חיידקים במגבונים) כדי להוסיף לחות לתאים. אין לדגור באינקובטור CO2, מכיוון שרמות CO2 גבוהות עלולות לפגוע בתאים.
