השגת פרוסות המוח הקטן ממוח אפרוח עוברי

תקציר

מקור: Hanzel, M., et al. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (2015).

הסרטון מדגים הכנת פרוסות במוח הקטן. זה מראה הליך מפורט לבידוד המוח הקטן מעובר אפרוח. לאחר מכן מכינים את הפרוסות מהמוח הקטן המנותח באמצעות מסוק רקמות לניתוח ניסיוני נוסף.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. נתיחת עובר תרנגולת יום 14 (e14) המוח הקטן

1. לדגור על ביצי תרנגולות מופרות חומות ב 38 מעלות צלזיוס ליום העוברי 14.
2. בעזרת מספריים לביצים, ערפו את ראשו של עובר האפרוח באובו והוציאו את ראשו לצלוחית פטרי המכילה מלח חיץ פוספט קר כקרח (PBS) (איור 1A).
3. באמצעות מלקחיים סטנדרטיים, לבצע חתכים מאחורי כל עין לאורך כל הרקמה, להסיר את העיניים ואת הלסת העליונה. בצעו חתך שני לאורך כל הלוע, והסירו את הלסת התחתונה (איור 1B).
4. באמצעות מלקחיים סטנדרטיים, הסירו את כל העור מפני השטח של גולגולת על-ידי קילופו (איור 1C) והסירו עצמות קדמיות וקודקודיות, מה שחושף את המוח.
5. מבחינה גחון, להסיר סחוס הלוע ואת mesenchyme עזר.
6. מההיבט הגבי, הסירו בזהירות את המזנכימה הגבי אל המוח האחורי, תוך זהירות שלא לפגוע ב-pia, והפרידו את המוח כולו (איור 1D).
7. בצעו חתך לאורך כל הרקמה שבין המוח התיכון למוח האחורי והפרידו את המוח האחורי, כולל המוח הקטן (איור 1E).
8. הסירו את המוח הקטן כולו על-ידי ביצוע חתכים לאורך כל הרקמה בשני הצמתים הרוחביים של המוח הקטן והצלחת האלרית של המוח האחורי, תוך הקפדה על שלמות ה-pia לאורך כל הדיסקציה (איור 1F). כמו כן, הסירו את מקלעת הכורואיד היוצרת (איור 1G).
9. העבירו את המוח הקטן המנותח לתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) הקרה כקרח.

2. תרבות פרוסות של המוח הקטן e14

1. מעבירים את המוח הקטן כולו למצע סטרילי של קוצץ רקמות בעזרת מרית או פיפטה של פסטר 3 מ"ל עם קצה חתוך להרחבת הצמצם. מוציאים את עודפי הנוזלים בעזרת פיפטה.
2. חותכים את המוח הקטן כולו כולו בכיוון הנדרש בעובי 300 מיקרומטר באמצעות סט מסוק רקמות במהירות חיתוך של 50% מהמקסימום. שלמות הרקמה נשמרת בקלות רבה ביותר בחתך קשת; עם זאת, התמצאות היא גם שיקול חשוב לניתוח תאים (דנדריטים של תאי Purkinje מיושרים באופן סגיטלי, בעוד אקסונים של תאי גרגיר רצים לרוחב, בניצב למישור של דנדריטים של תאי Purkinje).
3. בעזרת פיפטה של פסטר במינון 3 מ"ל, מכסים את המוח הקטן הפרוס ב-HBSS קר כקרח.
4. מעבירים את הפרוסות ב-HBSS לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה HBSS טרי וקר כקרח בעזרת פיפטת פסטר 3 מ"ל עם קצה חתוך.
5. תחת מיקרוסקופ מנתח המואר במקור אור סיב אופטי, יש להקפיד על הפרדה של פרוסות בודדות באמצעות מלקחיים שענים.
   הערה: כל דיסקציה, מהעובר ועד הדגירה של פרוסה בתווך התרבית, אורכת כ-10-20 דקות, תלוי בניסיון. בצע ניתוחים אחד בכל פעם כדי להבטיח שהסרבלה מבלה את פרק הזמן המינימלי בין עריפת ראשים לתרבות ex vivo.

תוצאות

איור 1. דיסקציה של המוח הקטן מעוברי אפרוח E14. (A) ערפו את ראשו של הגוזל שבביצה והוציאו את ראשו לתוך צלחת פטרי עם PBS קר כקרח. הסר את הלסת התחתונה ואת העיניים על ידי ביצוע חתך מאחורי העיניים והלוע (קו מקווקו). (B) הסר את העור מפני השטח של הגולגולת. (C) הסר את העצמות המצחיות והקודקודיות, ו-(D) הסר את המוח מהמזנכימה והסחוס הסובבים אותו. (E) תחת מיקרוסקופ מנתח לזהות את המיקום של המוח הקטן בקצה האחורי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסוק רקמות McIlwain	מיקל מעבדה הנדסה בע"מ		חותכים ב-300 מיקרומטר לקבלת התוצאות הטובות ביותר.