הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

תקציר

מקור: Malon, J. T., et al. הכנת תרביות גליה מעורבות ראשוניות מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גלייה מעורבים ראשוניים מרקמת חוט השדרה של עכבר בוגר. הפרוטוקול כולל עיכול אנזימטי של הרקמה, ואחריו הסרת קרומי תאים שבורים ופסולת מיאלין כדי להשיג אוכלוסייה של תא יחיד. לאחר מכן התאים מתורבתים במדיה המותאמת לגידול תאי גלייה מעורבים.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות בתרבית בתנאים אספטיים

1. הכנת מדיה תרבית: להשלים את השינוי של Dulbecco של מדיה של נשר (cDMEM) המכיל DMEM (עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 100 IU / מ"ל פניצילין, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 250 ng / mL Amphotericin B, ו 50 μM 2-mercaptoethanol (2-ME; ראה 1.1.1). ערבוב וסינון, עיקור כל שאר הרכיבים ולאחר מכן הוסף FBS. אחסן את מדיית התרבות ב^{- 4 °} C.
   1. הכן תמיסת מלאי של 50 mM 2-ME/פוספט-חוצץ מלוחים (PBS): הוסף 100 μL של 2-ME מרוכז (14.3 M) לתוך 28.6 מ"ל של 1x PBS, וסנן סטריליזציה (ניתן לאחסן את התמיסה ב 4 ^° C במשך מספר חודשים). השתמש ב-1 מ"ל של פתרון מלאי 2-ME עבור כל 1,000 מ"ל של מדיה תרבותית.
2. הכנת מדיית שיפוע הצפיפות
   1. הכינו תמיסת מדיה הדרגתית בצפיפות איזוטונית (למשל, 100% Percoll) מ-1 חלק 10x PBS סטרילי רגיל ו-9 חלקים מדיה הדרגתית סטרילית של צפיפות מלאי (למשל, Percoll).
   2. דלל את מדיית מעבר הצבע בצפיפות של 100% (מיוצרת ב- 1.2.1) עם PBS סטרילי רגיל 1x כדי ליצור מדיה הדרגתית בצפיפות של 20% (לדוגמה, 10 מ"ל של מדיה הדרגתית בצפיפות של 100% עם 40 מ"ל של PBS 1x) ואחסן אותה ב- 4 ^° C. הבא את מדיית שיפוע הצפיפות של 20% לטמפרטורת החדר (RT) לפני הכנת תרבית התא.
3. הכנת פתרונות ממערכת הדיסוציאציה פפאין
   הערה: ניתן לזהות את מערכת הדיסוציאציה של פפאין בטבלת החומרים. ניתן להשתמש גם בערכות דיסוציאציה דומות אחרות (כולל אלה שהורכבו בתוך הבית). כל הרכיבים חייבים להיות סטריליים.
   1. הוסף 32 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) לתערובת מעכבי ovomucoid (אבקה).
   2. הוסף 5 מ"ל של EBSS לבקבוקון פפאין אחד (אבקה). מניחים את בקבוקון הפפאין באמבט מים של 37 ^מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד להמסת הפפאין.
   3. הוסף 500 μL של EBSS לבקבוקון DNase אחד (אבקה). מערבבים בעדינות.
   4. הוסף 250 μL של תמיסת DNase (לעיל) לבקבוקון פפאין.
   5. חשב את הכמות הכוללת של תערובת פפאין/DNase לעיל הדרושה (כ- 800 מיקרוליטר תערובת פפאין/DNase לכל חוט שדרה של עכבר) והעבר את התערובת הדרושה לצינור של 50 מ"ל לעיכול רקמות. אחסנו את השאריות בבקבוקון המקורי בטמפרטורה של 4°C למשך שבועיים לפחות.
   6. יש לשמור את כל הרכיבים מהערכות על קרח עד לצורך.
4. הכינו צינורות איסוף חוטי שדרה: צינור סטרילי אחד של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS; ממערכת הדיסוציאציה של פפאין, לאיסוף חוטי השדרה) וצינור סטרילי אחד של 15 מ"ל עם 1x PBS (למילוי מזרק 5 מ"ל). בנוסף, הכינו צלחת פטרי סטרילית אחת (35 מ"מ או 60 מ"מ) עם 5 מ"ל HBSS ושמרו אותה במכסה המנוע.

2. הכנת מתלה תא בודד

הערה: בצע את שלבים 3 ו-4 במכסה מנוע של תרבית כדי לשמור על הכל סטרילי.

1. העבירו את כל חוטי השדרה לצלחת פטרי המכילה HBSS. חתכו כל אחד מחוט השדרה לחתיכות קטנות ועדינות רבות בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים. העבירו את רקמת חוט השדרה לצינור החרוטי 50 מ"ל המכיל את תערובת האנזימים פפאין/DNase מוכנה (שלב 1.3.5) באמצעות מלקחיים סטריליים או פיפטה של 10 מ"ל (הימנעו מהוספת HBSS לתערובת האנזימים, שכן הדבר ידלל עוד יותר את תמיסת האנזים המוכנה ועלול לגרום לביצועים ירודים של האנזים).
2. מערבבים את הצינור בעדינות כדי לערבב. לדגור על הצינור ב 37 ^oC במשך 1 שעה באינקובטור / שייקר עם רעידות מסלוליות ב 150 סל"ד.
3. מערבלים שוב את הצינור ומטריטורים במרץ את תמיסת האנזים עם הרקמה באמצעות פיפטה של 5 מ"ל כדי לקדם דיסוציאציה נוספת.
4. העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
5. במהלך הצנטריפוגה, מערבבים 2.7 מ"ל EBSS עם 300 μL של תמיסת מעכב אלבומין-אובומוקואיד משוחזרת (1.3.1) בצינור סטרילי. הוסף 150 μL של תמיסת DNase (שלב 1.3.3).
6. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את גלולת התא עם התמיסה שהוכנה לעיל (שלב 1.5). מערבולת היטב כדי לשבור את גלולת התא.
7. הוסף 3 מ"ל של תמיסת מעכב אלבומין-ovomucoid משוחזרת (שלב 1.4.1) להשעיית התא. תאי צנטריפוגה ב 70 x גרם במשך 6 דקות ב RT. הסר את supernatant (אשר מכיל שברי ממברנה).

3. הסרה נוספת של המיאלין מתרחיף התא הבודד

1. הוסף 8 מ"ל של מדיה הדרגתית בצפיפות 20% (שהוכנה בשלב 1.2.2) לתוך הצינור המכיל את כדורית התא, מערבל בעדינות כדי לשבש את הכדור, וצנטריפוגה את התאים ב 800 x גרם במשך 30 דקות ב- RT ללא בלימה. בזהירות להסיר את השכבה העליונה של פסולת (בעיקר מיאלין) ואת supernatant אבל לשמור את הכדורית.
2. כדי להסיר שרידים של שיפוע הצפיפות, לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של גלולת התא עם 8 מ"ל של cDMEM מדולל (1 חלק cDMEM ו 2 חלקים HBSS). צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ^oC. להסיר את supernatant ולשטוף את התאים שוב עם cDMEM מדולל (לעיל) באותו אופן. שמור את התאים על קרח עד זריעתם.
3. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא במדיה תרבית (cDMEM מסופק עם 2-ME (מוכן בשלב 1.1)). עבור צלחת אחת של 12 בארות, השתמש 3 מ"ל x 4 (מספר העכברים בשימוש) + 2 מ"ל = 14 מ"ל מדיה. זה יבטיח שיש מספיק תרחיף תאים עבור הצלחת כולה (12 בארות) ויספק בארות נוספות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את מספר התא הממוצע לכל באר ואת תכולת מיקרוגליה של התרבית. אם ייעשה שימוש בסוגים אחרים של כלי תרבות, חשב את הנפח הכולל של אמצעי התרבות הדרושים באופן יחסי.
4. הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת 12 באר.
5. לדגור על התאים ב 35.9 ^oC עם 5% CO₂.
6. שנה את המדיה (הסר מדיה ישנה באמצעות שאיפה) ב- D 1 ולאחר מכן כל 3 - 4 d לאחר מכן (בדרך כלל שנה את המדיה ב- D: 1, 4, 8 ו- 11, ולאחר מכן השתמש בתאים ביום 12).
   הערה: ביום הראשון, התרבית עשויה להכיל כמויות משמעותיות של פסולת עקב שאריות המיאלין מרקמת חוט השדרה; לכן, מומלץ לשנות את המדיה ביום הראשון. תרביות מוכנות לטיפול בין ד 12 - 14. התאים בדרך כלל נפגשים ב-80% ב-D 12 ויכולים להיות קרובים ל-100% במפגש ב-D 14. בדרך כלל, ב-D 12 יש כ-100,000 תאים לבאר בצלחת בת 12 בארות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שינוי של Dulbecco של מדיה של נשר (DMEM) עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז	לונזה	12-709F	המדיה cDMEM היא מדיה תרבותית סטנדרטית ונפוצה. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש את ה- DMEM ואת כל הרכיבים האחרים המשמשים לייצור מדיה cDMEM.
ל-גלוטמין (100x)	לונזה	17-605E	L-גלוטמין הוא רכיב סטנדרטי הנמצא בשימוש נרחב במדיות תרבות שונות. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש L-גלוטמין.
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (100x)	קורנינג-מדיטק	30-004-CI	זהו שילוב של פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין שנוסחו להכיל 10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 10 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין סולפט ו 25 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B. חוקרים בודדים יכולים להחליט היכן לרכוש רכיבים בודדים.
2-מרקפטואתנול (2-ME)	סיגמא-אולדריץ'	M3148	ביו-ריאגנט, מתאים לתרבית תאים, ביולוגיה מולקולרית ואלקטרופורזה.
מערכת דיסוציאציה פפאין	תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטון	LK003150	רכיבים בודדים של ערכה זו ניתן לרכוש בנפרד.
פרקול	GE שירותי בריאות	17-0891-01	פרקול נמכרת כתמיסה סטרילית. פרקול לא מדולל ניתן re- autoclaved במידת הצורך.
חממה/שייקר קו מעבדה	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	זו החממה/שייקר שיש לנו כרגע. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של שייקרים במקום.