1. שמירה על התחדשות עצמית בתאי IMOP
- הכינו מדיית תרבית iMOP: DMEM/F12, תוסף B27 1X, 25 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-20 נ"ג/מ"ל גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF). הפוך 50 מ"ל של מדיה תרבית iMOP באמצעות ריאגנטים סטריליים. יש לחמם 49 מ"ל של DMEM/F12 בחרוטי של 50 מ"ל באמבט מים של 37°C.
- הפשירו תוסף 50X B27 ו-100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין אליציטוטים מעוקרים בסינון למשך 5 דקות באמבט מים של 37°C. הפשירו 100 מיקרוגרם/מ"ל bFGF aliquot ב-RT. הוסיפו 1 מ"ל 50X B27, 10 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל bFGF ו-12.5 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין ל-DMEM/F12.
- יש להשתמש ב-3 מ"ל של מדיה בצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ לגידול תאי iMOP. הוסף מדיה רעננה לתרבויות כל יומיים על ידי הכפלת נפח המדיה. יש לוודא שהריכוז של bFGF אינו יורד מתחת ל-5 נ"ג/מ"ל.
- תאי iMOP בתרבית בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. תאי מעבר בתרבית לאחר 5 - 7 ימים כמפורט בשלבים הבאים. מעבירים את התרבית לחרוט של 15 מ"ל בעזרת קצה פיפטה של 10 מ"ל.
- הפוך 1 mM EDTA ב HBSS על ידי דילול 0.1 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0 לתוך 50 מ"ל של HBSS. טרום חם 1 mM EDTA עשה HBSS באמבט מים 37 ° C.
- קצור תאים על ידי שקיעת כוח הכבידה או צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT. עבור שקיעת כוח הכבידה, מניחים את החרוט 15 מ"ל המכיל את התרביות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 דקות. לאחר זמן זה, להתבונן otospheres לאסוף בחלק התחתון של 15 מ"ל חרוטי.
הערה: כוח צנטריפוגלי מוגזם עלול לגרום נזק לתאים.
- יש לשאוף בזהירות מדיה משומשת באמצעות פיפטה שואפת 2 מ"ל מבלי להפריע לכדורית התא. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת 1 mM EDTA HBSS שחוממה מראש לכדורית התא. בעזרת פיפטה P1000, מזלפים בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים. מניחים חרוטי ב 37 ° C ודגור במשך <5 דקות כדי להקל על דיסוציאציה לתוך תאים בודדים.
- מערבלים בעדינות את תמיסת התא כדי לקבוע אם האוטוספרות מנותקות. אם אין משקעים אוטוספיריים לתחתית החרוט, התאים מנותקים. זמן הדגירה עשוי להשתנות.
הערה: דגירה ממושכת עם EDTA תגרום למוות תאי מוגזם.
- הסר תאים מ 37 ° C, להוסיף 2 מ"ל של מדיה כדי לנטרל ולדלל את EDTA. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף החוצה EDTA מדולל באמצעות פיפטה 2 מ"ל שאיפה ולהוסיף 5 מ"ל של 1X PBS כדי לשטוף את התאים.
- סובבו תאים כלפי מטה במהירות של 200 x גרם במשך 5 דקות ב-RT ושאפו החוצה 1X PBS באמצעות פיפטה שואפת 2 מ"ל. השהה מחדש את התאים באמצעות פיפטה P1000 ב 0.5 מ"ל של מדיה תרבית iMOP על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
- ספירת תאים באמצעות מונה חלקיקים מיקרופלואידים עם הקלטות המתאימות. צלחת מפגש של תאי iMOP תכיל ~6 X10 6 תאים. לדלל תאים 1:100 במדיה ולהוסיף 75 μl של תמיסת תאים לתוך קלטת לספירה. צלחת 1 x 106 תאים בצלחת 6 ס"מ במדיה תרבית iMOP (~ 1: 10 דילול). מעבר iMOPs כל 5 - 7 ימים.
הערה: תאים היוצרים אוטוספרות גדולות או נצמדים לתחתית צלחת תרבית הרקמה יתמיינו. תאים ימותו גם אם התרביות נפגשות יתר על המידה.
2. התמיינות תאי IMOP לאפיתליה חושית
- הכינו 50 מ"ל של אמצעי התמיינות אפיתליה חושית iMOP: DMEM/F12, תוסף B27 1X, 25 מיקרוגרם/מ"ל קרבנצילין. הפוך 50 מ"ל של iMOP אפיתל חושי התמיינות מדיה. יש לחמם 49 מ"ל של DMEM/F12 בחרוטי של 50 מ"ל באמבט מים של 37°C. יש להפשיר תוסף B27 50X ו-100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין אליציטוטים למשך 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. הוסף 1 מ"ל 50X B27 ו 12.5 μl של 100 מ"ג / מ"ל carbenicillin לתוך DMEM/F12.
- כדי לקצור, לנתק, להשהות מחדש ולספור תאים, חזור על שלבים 1.4-1.9
- צלחת 1 x 106 תאים בצלחת 6 ס"מ ביום -3 באמצעות תרבית iMOP. ביום 0, מעבירים את התרביות באמצעות פיפטה של 10 מ"ל לחרוט של 15 מ"ל. אספו את האוטוספרות על ידי שקיעת כוח הכבידה, כאמור בשלב 1.6. שאפו החוצה מדיה משומשת באמצעות פיפטה שואפת 2 מ"ל והשאירו את האוטוספרות בתחתית החרוט.
- מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של אמצעי התמיינות אפיתליה חושית. מעבירים אוטוספרות לצלחת בקוטר 6 ס"מ בעזרת פיפטה גדולה של 10 מ"ל פיפטה.
הערה: גזירה מכנית מצנרת קשה יכולה לנתק תאים מהאוטוספרות.
- יש להוסיף 2 מ"ל של חומר התמיינות אפיתל חושי טרי לתרביות אחת ליומיים. במידת הצורך, תאים יכולים להיאסף על ידי שקיעת כוח הכבידה ולהחליף מדיה.
- אספו אוטוספרות ביום 10 על ידי העברה לחרוט של 15 מ"ל ואפשרו לאוטוספרות לשקוע כאמור בשלב 1.6. לשאוף את המדיה בילה באמצעות פיפטה 2 מ"ל שואף ולהשאיר את otospheres ללא הפרעה.
- תקן אוטוספירות על ידי דגירה של 4% פורמלדהיד ב-1X PBS למשך 15 דקות ב-RT. הסר את תמיסת הפורמלדהיד ושטוף את האוטוספירות עם חיץ שטיפה (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני הדגירה בחיץ חוסם (1X PBS המכיל 10% סרום עיזים רגיל ו-0.1% Triton X-100) למשך שעה אחת.
- החלף את החיץ ודגר על דגימות בחיץ חוסם בנוגדן מדולל. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C. יש לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל 0.1% Triton X-100 ולחשוף את האוטוספירה לכתמים חיסוניים. העבירו אוטוספירות ל-1X PBS ומקמו את האוטוספירות באמצעי הרכבה על שקופית זכוכית באמצעות פיפטה P1000. הניחו כיסוי על הדגימה ואפשרו למדיית ההרכבה להתייבש בטמפרטורה של 4°C.
- השג תמונות אפיפלואורסצנטיות באמצעות מערך מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת CCD של 16 סיביות ומטרת טבילת שמן 20X 0.75 או 40X 1.3 NA. אסוף פלואורסצנטיות מתעלות צבע שונות באמצעות אורכי הגל המפורטים (עירור ופליטה): כחול (377 ± 25 ננומטר/447 ± 30 ננומטר), ירוק (475 ± 25 ננומטר/540 ±-25 ננומטר), אדום (562 ± 20nm/ ו-625 ±-20nm) ואינפרא-אדום (628 ± 20nm/ ו-692 ±-20 ננומטר).
