התמיינות תאי אב אוטיים לתאי אפיתל חושיים ואחריה אימונוסטיין

תקציר

מקור: Azadeh, J. et al., Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי אב אופטיים רב-פוטנטיים אימורטליים (iMOP) לתאי אפיתל חושיים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בטיפוח תאי iMOP, יצירת אוטוספירות, גרימת התמיינות והדמיית רכיבים תאיים וסמני התמיינות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר התמיינות תאים מוצלחת.

פרוטוקול

1. שמירה על התחדשות עצמית בתאי IMOP

1. הכינו מדיית תרבית iMOP: DMEM/F12, תוסף B27 1X, 25 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצילין ו-20 נ"ג/מ"ל גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF). הפוך 50 מ"ל של מדיה תרבית iMOP באמצעות ריאגנטים סטריליים. יש לחמם 49 מ"ל של DMEM/F12 בחרוטי של 50 מ"ל באמבט מים של 37°C.
   1. הפשירו תוסף 50X B27 ו-100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין אליציטוטים מעוקרים בסינון למשך 5 דקות באמבט מים של 37°C. הפשירו 100 מיקרוגרם/מ"ל bFGF aliquot ב-RT. הוסיפו 1 מ"ל 50X B27, 10 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל bFGF ו-12.5 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל קרבניצילין ל-DMEM/F12.
2. יש להשתמש ב-3 מ"ל של מדיה בצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ לגידול תאי iMOP.....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויי זכוכית בעובי 1.5 (עגול 12 מ"מ)	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72230-01
DMEM/F12	לייף טכנולוגיות	11320-082
פוספט מלח חוצץ (PBS) pH 7.4	לייף טכנולוגיות	10010-023
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	לייף טכנולוגיות	14025-092
תוסף B27 (50X) ללא סרום	לייף טכנולוגיות	17504-044	מאוחסן כמו 1 מ"ל aliquots
הארכת זהב נגד דהייה mountant	לייף טכנולוגיות	47743-736	מאוחסן כמו 10 מ"ג / מ"ל 100 μl aliquots
Moxi Z מיני מונה תאים אוטומטי	אורפלו	MXZ001
Moxi Z קלטת סוג S	אורפלו	MXC002
גורם גדילה רקומביננטי מורין פיברובלסט, בסיסי (bFGF)	פפרוטק	450-33	מושעה מחדש ב-0.1% BSA ב-H20 ומאוחסן כ-20 מ"ג/מ"ל אליציטוטים
קרבניצלין, מלח דיסודיום	תרמו פישר סיינטיפיק	BP2648-1	מושעה מחדש ב 10mM Hepes pH 7.4 ומאוחסן כמו 100 מ"ג / מ"ל aliquots
5 מ"ל פיפט בכריכה רכה באריכה רכה בנפרד (200/מארז)	תרמו פישר סיינטיפיק	1367811ד
10 מ"ל פיפט בכריכה רכה באריכה רכה בנפרד (200/מארז)	תרמו פישר סיינטיפיק	1367811E
תרבית רקמות מטופלת צלחת 6 ס"מ	תרמו פישר סיינטיפיק	130181
טיפים לפיטט מסנן TipOne 0.1-10 ul קצה מסנן מוארך	ארה"ב סיינטיפיק	1120-3810
טיפים לפיפת מסנן TipOne 1-20 ul טיפ מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-1810
טיפים לפיטט מסנן TipOne 1-200 ul טיפ מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-8810
טיפים לפיטט מסנן TipOne 101-1000 ul טיפ מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1126-7810
15 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)	ארה"ב סיינטיפיק	1475-0511
50 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)	ארה"ב סיינטיפיק	1500-1211