הבחנה בין אבות אוטיים רב-פוטנטיים אלמותיים לנוירונים של גנגליון ספירלי והערכת ההתמיינות

תקציר

מקור: Azadeh, J., et al. התחלת התמיינות בתאי אב אוטיים מולטיפוטנטיים אימורטליים. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון מדגים את ההתמיינות של אבות אוטיים מולטיפוטנטיים (iMOPs) אלמותיים לנוירוני גנגליון ספירליים (SGNs) ואישור מבוסס אימונופלואורסנציה להתמיינות. ה-iMOPs מצופים על גבי כיסויים מצופים מצע תרבית במדיום התמיינות עצבי לצורך התמיינות ל-SGNs. התאים המובחנים מסומנים בנוגדנים ספציפיים לסמני התמיינות עצביים ומנותחים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות.

פרוטוקול

1. הבחנה בין נוירונים שמקורם ב-iMOP

1. הפוך 50 מ"ל של מדיה התמיינות עצבית: מדיה נוירובזלית, 1X תוסף B27, 2 mM L-גלוטמין. הפשירו בקבוק 50X B27 ו-200 mM L-גלוטמין באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. הוסף 1ml 50X B27 ו 0.5 מ"ל 200 mM L-גלוטמין ל 48.5 מ"ל של מדיה נוירובזלית.
2. יש לצפות את הזכוכית על ידי הנחת כיסויי זכוכית עגולים 1.5 מ"מ בקוטר 12 מ"מ בצלחת סטרילית בקוטר 10 ס"מ ולהוסיף 70% אתנול (EtOH) לצלחת כדי לעקר ולנקות את הכיסויים.
3. יש להסעיר בעדינות את הכיסויים כדי לוודא שהם מכוסים באתנול. השאירו את הצלחת למשך 10 דקות ב-RT. שטפו את הכיסויים 3 פעמים במי מלח סטריליים חוצצים בפוספט 1X (PBS) כדי לשטוף את יתרת האתנול. שטפו את הכיסוי פעם אחת עם H₂O סטרילי כדי לשטוף את 1X PBS הנותרים.
4. יש לשאוף את ה-H₂O באמצעות פיפטה שואפת 2 מ"ל ולתת לכיסויים להתייבש. יש לחשוף את הכיסויים לאור UV במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך 15 דקות. יש לאחסן את הכיסויים בסביבה סטרילית אם לא נעשה בהם שימוש מיידי.
5. מניחים מכסה עגול אחד בקוטר 12 מ"מ בכל באר של צלחת בת 24 בארות. נערו את הצלחת בעדינות כדי להבטיח שהכיסויים ישכבו שטוחים בתחתית הבאר.
6. יש להפשיר 2 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין בטמפרטורת החדר (RT) ולדלל לריכוז פולי-D-ליזין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-1X PBS. הוסף 0.25 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פולי-D-ליזין לבארות. השאירו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
7. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS. הפשירו 10 מ"ג/מ"ל תמיסת ציר למינין ב-RT ודללו ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-1X PBS. הוסף 0.25 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל פתרון עבודה למינין לבאר אחת של צלחת 24 רב באר. לדגור על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שאפו החוצה את תמיסת הלמינין באמצעות פיפטה שואפת 2 מ"ל.
8. שטפו את הכיסוי 3 פעמים עם 1X PBS על ידי הוספת 1 מ"ל של 1X PBS עם פיפטה P1000 והסרת 1X PBS על ידי שאיפה עם פיפטה 2 מ"ל. השאירו 1X PBS מהשטיפה האחרונה בבאר עד שהתאים מוכנים לצפייה. ליזום התמיינות עצבית על ידי קציר, ניתוק וספירת תאים. צלחת 1 x 10⁶ תאים בכלי 6 ס"מ ביום -3.
9. ביום 0, קצור, נתק וספור תאים. זרע 1 x 10⁵ - 1.5 x 10⁵ תאי iMOP לתוך 0.5 מ"ל מראש מחומם נוירונים התמיינות מדיה לכל באר בצלחת 24 רב באר. שאפו והוסיפו אמצעי התמיינות עצבית שחוממו מראש לתרבויות כל יומיים.
10. תקנו תאי עצב שמקורם ב-iMOP בפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות ב-RT ביום השביעי. הסר תמיסת פורמלדהיד, שטוף נוירונים שמקורם ב- iMOP עם חיץ שטיפה (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני הדגירה בחיץ חוסם (1X PBS המכיל 10% סרום עיזים רגיל ו- 0.1% Triton X-100) למשך שעה אחת.
    1. החלף את החיץ ודגר על דגימות בחיץ חוסם בנוגדן מדולל. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C. יש לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל 0.1% תאי Triton X-100 הנושאים את החיסון. שטפו את זכוכית הכיסוי עם 1X PBS לפני הנחתכם על אמצעי הרכבה. הניחו למדיית ההרכבה להתייבש בטמפרטורה של 4°C לפני קבלת תמונות אפיפלואורסצנטיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויי זכוכית בעובי 1.5 (עגול 12 מ"מ)	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 7	72230-01
DMEM/F12	לייף טכנולוגיות	11320-082
מדיום נוירובזלי	לייף טכנולוגיות	21103
פוספט מלח חוצץ (PBS) pH 7.4	לייף טכנולוגיות	10010-023
תוסף B27 (50X) ללא סרום	לייף טכנולוגיות	17504-044	מאוחסן כמו 1 מ"ל aliquots
ל-גלוטמין(200 מילימול)	לייף טכנולוגיות	25030-081	מאוחסן כמו 5 מ"ל aliquots
למינין עכבר טבעי	לייף טכנולוגיות	23017-015	מאוחסן כמו 1 מ"ג / מ"ל aliquots
הארכת זהב נגד דהייה mountant	לייף טכנולוגיות	47743-736	מאוחסן כמו 10 מ"ג / מ"ל 100 μl aliquots
Moxi Z מיני מונה תאים אוטומטי	אורפלו	MXZ001
Moxi Z קלטת סוג S	אורפלו	MXC002
פולי-די-ליזין	סיגמא	P7886	מושעה מחדש ב 1X PBS ומאוחסן כמו 10 מ"ג / מ"ל 100 μl aliquots
5 מ"ל פיפט בכריכה רכה באריכה רכה בנפרד (200/מארז)	תרמו פישר סיינטיפיק	1367811ד
10 מ"ל פיפט בכריכה רכה באריכה רכה בנפרד (200/מארז)	תרמו פישר סיינטיפיק	1367811E
תרבית רקמות מטופלת ביוליט 24- צלחת באר	תרמו פישר סיינטיפיק	130188
תרבית רקמות מטופלת ביוליט 6- צלחת באר	תרמו פישר סיינטיפיק	130184
תרבית רקמות מטופלת צלחת 6 ס"מ	תרמו פישר סיינטיפיק	130181
EMD Millipore Millex מזרק סטרילי מסנן PVDF גודל נקבוביות: 0.22 מיקרומטר	תרמו פישר סיינטיפיק	SLGV033RS
טיפים לפיטת מסנן TipOne 0.1 - 10 μl קצה מסנן מוארך	ארה"ב סיינטיפיק	1120-3810
טיפים לפיפט מסנן TipOne 1 - 20 μl קצה מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-1810
טיפים לפיפט מסנן TipOne 1 - 200 μl קצה מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-8810
טיפים לפיפת מסנן TipOne 101 - 1000 μl קצה מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1126-7810
15 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)	ארה"ב סיינטיפיק	1475-0511
50 מ"ל צינורות חרוטיים סטריליים 20 שקיות של 25 צינורות (500 צינורות)	ארה"ב סיינטיפיק	1500-1211