כל נהלי מודל בעלי החיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים, וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE בחנה את כל נהלי מודל בעלי החיים.
1. הזדווגויות מתוזמנות
- מקום ISLMN:GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק של נוירון מוטורי; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J מספר מלאי: 017952) עכברים זכרים ונקבות יחד למשך הלילה. לשקול את הנקבות ולרשום משקלים לפני ההזדווגות.
הערה: ISLMN:GFP מתייג באופן ספציפי נוירונים מוטוריים עם GFP פארנזילציה שאינו ציטוטוקסי, ממוקם בקרום התא של נוירונים מוטוריים והאקסונים שלהם, ומאפשר לדמיין את העצבים במהלך ההתפתחות. ניתן להשתמש גם בקווים אחרים המסומנים באופן פלואורסצנטי.
- בדוק אם יש פקקים בנרתיק בשעות הבוקר המוקדמות. תאריך זיהוי התקע מסומן כ- E0.5.
- יש לאשר הריון באמצעות עלייה במשקל ו/או אולטרסאונד ביום העוברי 10.5 (E10.5). סכרים בהריון היו צריכים להרוויח לפחות 1 גרם. עוברים ניתן לראות על אולטרסאונד ב E10.5.
2. הכנת ריאגנטים וויברטום לתרבית פרוסות
- הכינו 500 מ"ל של חיץ חיתוך: הוסיפו 5 מ"ל של HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) ו-5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין ל-500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של Hank (HBSS) ללא Ca2+ ו-Mg2+. מצננים ל-4°C.
הערה: יש לאחסן את מאגר הפריסה הנוסף בטמפרטורה של 4°C וניתן להשתמש בו לניסויים עתידיים בתרבית פרוסות.
- הכן 50 מ"ל של מדיה תרבותית: במכסה מנוע סטרילי, להוסיף 12.5 מ"ל של HBSS, 12.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 250 μL של גלוקוז, 250 μL של L-גלוטמין, 125 μL של HEPES ל 24.4 מ"ל של DMEM Fluorobright (מדיום הנשר השונה של Dulbecco). (ריכוזים סופיים: FlouroBright DMEM עם 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% גלוקוז, 1 mM גלוטמין ו-2.5 mM HEPES). חממו את אמצעי התרבות ל 37 °C באמבט מים סטריליים.
הערה: ניתן לאחסן מדיה תרבותית ב 4 ° C עד 3 שבועות.
- במכסה מנוע סטרילי, מוסיפים 1.5 מ"ל של מדיה תרבותית לכל באר של צלחת 6 בארות. הוסף תוספת תרבית תאים (טבלת חומרים) לכל באר. מניחים באינקובטור סטרילי של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- הכן 4% טמפרטורת התכה נמוכה agarose: להמיס 2 גרם של טמפרטורת התכה נמוכה agarose ב 50 מ"ל של PBS סטרילי. יש לחמם במיקרוגל במרווחים של 30-60 שניות עד להמסה מלאה. יש להכניס לאמבט מים בטמפרטורה של 40°C כדי לשמור על נוזלים.
הערה: ניתן לאחסן אגרוז נוסף בטמפרטורת החדר (RT) ולהמיס אותו לניסויים עתידיים בתרבית פרוסות.
- הגדרת ויברטום: הניחו להב חדש על ויברטום. בדוק הגדרות: עובי 400-450 מיקרומטר. מצננים מראש את שלב הוויברטום. הניחו מעט קרח בתא החיצוני. השתמשו בחדר ובבמה המוקדשים לפרוסות חיות. אין להשתמש באותו תא רטט עבור רקמה קבועה מכיוון שקיבוע שיורי עלול להזיק לפרוסות.
- הכינו את האינקובטור העליון בשלב המיקרוסקופ לטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- הכנה לנתיחה: יש לנקות את כלי הניתוח ולרסס באתנול 70%. ממלאים שתי צלחות פטרי ב-HBSS, מניחים על קרח. פתחו צלחת תרבית של 12 רקמות היטב והניחו את המכסה על קרח כשהחלק התחתון פונה כלפי מעלה. פתח צלחת תרבית רקמה 6 באר ומקם תוספות קרום תרבית תאים ו 1.5 מ"ל תרבית תאים מדיה בכל באר. מחממים מראש את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
3. קצירת עוברי E10.5 והכנת פרוסות
הערה: יש לבצע את כל השלבים מנקודה זו במהירות האפשרית. שמור את העוברים על קרח בכל עת.
- הרדימו את הסכר ההרה (E10.5) בתא CO2. לבצע פריקת צוואר הרחם.
- רססו את הבטן באתנול 70%. לפתוח את הבטן עם מספריים, להסיר את הרחם ומניחים אותו בצלחת פטרי עם HBSS קר כקרח כדי לשטוף במהירות את הדם. העבירו את הרחם השטוף לפטרי שני מלא בצלחת HBSS קרה כקרח.
- תחת טווח ניתוח, הוציאו את העוברים מקרן הרחם ושקי מי השפיר הבודדים. הניחו את העוברים על החלק התחתון של המכסה של צלחת 12 בארות. שמור על קרח.
- תחת טווח ניתוח, השתמש בנייר סינון כדי להסיר כל נוזל המקיף כל עובר.
הערה: עוברים יידבקו לנייר הסינון אם יגעו בהם.
- להטמיע עוברים באגרוז. יוצקים אגרוז מומס על כל עובר כדי לכסות אותו. שמור על קרח. ברגע שהאגרוז התקשה, הופכים כל עובר ויוצקים אגרוז נוסף בצד השני. שמור על קרח.
- בעזרת טווח חיתוך פלואורסצנטי, חותכים את האגרוז סביב כל עובר כך שהוא יהיה מכוון כראוי כאשר הוא מודבק לשלב הוויברטום. הגרעין האוקולומוטורי וצמיחת האקסון המוקדמת הם פלואורסצנטיים. יישרו את העובר כך שהגרעין, האקסונים הגדלים והעין ייצרו קו, וקצצו את האגרוז עם סכין גילוח החתוך במקביל לקו זה (גבי לעובר, ראו איור 1A).
הערה: זה יהיה הצד המודבק לשלב הוויברטום (העובר ימוקם על גבו, ראשו הקרוב ביותר ללהב הוויברטום). קו בין הגרעין האוקולומוטורי לעין צריך להיות מקביל ללהב הוויברטום.
- מלאו את תא הוויברטומה במאגר פרוסות קר כקרח. הדביקו את העובר לשלב הוויברטום, כך שהלהב יהיה מקביל לגרעין האוקולומוטורי ולעיניים. ברגע שדבק-העל יבש, יש לטבול את שלב הוויברטום, כך שהעובר יהיה מכוון כלפי חוץ מהלהב.
- פורסים פרוסות 400-450 מיקרומטר. אוספים כל פרוסה עם צינור העברה סטרילי. מניחים במאגר חיתוך קר.
- תחת טווח הניתוח, בחר את הפרוסה המכילה את הגרעינים האוקולומוטוריים ואת העיניים. בעזרת צינור העברה סטרילי, מניחים אותו על תרבית התא בצלחת 6 הבאר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, בקשו מאדם אחד לחתוך ואדם אחר להניח את הפרוסות. מזערו את הזמן בין החיתוך לכניסה לאינקובטור.
הערה: פרוסות צריכות להיות מכוונות כך שהפלואורסצנטיות המקסימלית הנפלטת מהגרעינים והאקסונים תהיה הקרובה ביותר למטרת מיקרוסקופ ההדמיה. במיקרוסקופ הפוך, יש להניח את הפרוסות על הממברנה עם הגרעינים והאקסונים הקרובים ביותר למטרה שמתחת לצלחת.
- מוציאים את שאריות האגרוז משלב הוויברטום, מדביקים את העובר הבא לשלב וחוזרים על שלבים 3.7-3.9 עד שכל העוברים נחתכים ומצופים.
- הוסף מעכב או מולקולה רקומביננטית לפי בחירה למדיה בכל באר כדי ליצור עקומת מנה-תגובה. לדלל בממס מתאים.
הערה: אם אתם משתמשים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), השתמשו רק ב-DMSO בדרגת תרבית רקמה. לחלופין, ניתן להניח חרוזים פולטי חלבון במקומות ספציפיים על הפרוסה.
- מניחים על המיקרוסקופ בתא 37°C ו-5% CO2. הגדר את המיקרוסקופ לצלם ניגודיות פאזה ותמונות פלורסנט של כל פרוסה כל 30 דקות (או לעתים קרובות יותר אם תרצה). פרוסות ניתן לשמור במשך 48-72 שעות.
