כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הכנת מכשירים, פתרונות ומדיה
הערה: כל המידע על חומרים, ריאגנטים, כלים ומכשירים המדווחים בפרוטוקול מצוין בטבלת החומרים.
- בצע אוטוקלבה לכל מכשירי הדיסקציה ואחסן אותם באזור סטרילי. השתמש במכשירים הבאים: 4 מלקחיים סטנדרטיים (2 ארוכים ו -2 קצרים) ו -2 מספריים, כמו גם 2 מלקחיים (1 ארוך ו -1 קצר) ומספריים אחד לדיסקציה; שמור סט נוסף כגיבוי.
- הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS)/1% סרום בקר עוברי (FBS) לשימוש במהלך שטיפות, הליכי סימון חיסוני ושלבי מיון תאים. שמור את התמיסה מקוררת ב 4 ° C.
הערה: אין להוסיף נתרן אזיד (NaN3) לתמיסה, מכיוון שהיא עלולה להיות רעילה לתאים חיים.
- הכן 100 מ"ל של PBS / 1% FBS עם 99 מ"ל של PBS ו 1 מ"ל של FBS.
- הכינו 100 מ"ל של תווך תאי עצב סטריליים בתוספת 3% FBS (ראו טבלת חומרים) לשימוש כמדיום איסוף ותרבית. שמור על תרבית תאים סטרילית בינונית ב 4 ° C. יש לחמם אותו רק לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
- הכן 100 מ"ל של מדיום תא עצבי בתוספת FBS 3% באמצעות 97 מ"ל של תווך תא עצבי ו 3 מ"ל של FBS.
- צינורות איסוף טרום קירור (צינורות 15 מ"ל) מצופים מראש במדיום איסוף של 5 מ"ל על ידי הכנסתם לדלי קרח. השתמש רק צינורות פוליפרופילן כדי למנוע מהתאים להיצמד לפני השטח של הצינור.
- הניחו בארון הבטיחות הביולוגית כלים בקוטר 40 מ"מ, מסננות ניילון בגודל 70 מיקרומטר, מזרקים, מזיקים למסננת התא וצינורות פוליפרופילן סטריליים. לעקר את כל הפריטים לפני ההליכים ולתחזק אותם בצורה סטרילית לאורך כל ההליכים.
הערה: כל השלבים לאחר איסוף הרשתית יבוצעו בארון הבטיחות הביולוגית.
2. הכנת תרחיף תאי הרשתית
- הניחו את העין שנאספה על צלחת הבסיס של מיקרוסקופ דיסקציה כדי להתחיל את דיסקציית הקרנית. נתחו כל עין בנפרד.
- בזהירות להחזיק את הגלובוס בבסיס עצב הראייה באמצעות מלקחיים. עבור שלב זה, השתמש במלקחיים סטנדרטיים אחד ארוך ואחד קצר.
- השתמש במחט חדה של 30 מד (30G) כדי לנקב את הקרנית. זה יאפשר להומור המימי להתפנות מהעין, מה שיקל על אחיזת העין עם המלקחיים.
- החזיקו את הקרנית עם המלקחיים והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן בקרנית. מקלפים בעדינות את הקרנית ואת לובן העין בעזרת המלקחיים. כאשר הגלובוס מקולף באמצע הדרך, גלגלו את הרשתית והעדשה החוצה באמצעות המלקחיים. השליכו את הקרנית, הסקלרה והעדשה.
הערה: שיטה זו מבטיחה שהרשתית תתנתק לחלוטין משאר העין.
- מניחים את הרשתית בכלי פטרי קטן בקוטר 40 מ"מ המכיל PBS/1% FBS.
הערה: כחלופה לצלחת הפטרי, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאים. הקפידו תמיד לשמור על הרשתית לחה, כמו במצבים פיזיולוגיים.
- יש לשטוף כל רשתית שלוש פעמים עם PBS סטרילי טרי/1% FBS בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
- הניחו עד 12 רשתיות על מסננת ניילון סטרילית בגודל 70 מיקרומטר עם PBS/1% FBS. בעזרת הקצה האחורי של מזרק בנפח 10 מ"ל, השרו בעדינות את הרשתית בתנועה מעגלית כדי לנתק את התאים.
- לחלופין, השתמש במזיק עבור maceration מסננת התא או להשתמש בעיכול אנזימטי עם שילוב של 15 IU / מ"ל פפאין, 5 mM L-ציסטאין, ו 200 U/mL DNase I במשך 15 דקות ב 37 ° C, ולאחר מכן השבתה עם PBS / 10% FBS.
הערה: לא נצפו שינויים באחוז התאים שהתאוששו כאשר העיכול האנזימטי הושווה למקרציה עם הקצה האחורי של המזרק או עם המזיק.
- כדי להעביר את התאים המבודדים, הניחו את מסננת הניילון הסטרילית בגודל 70 מיקרומטר מעל צינור איסוף הפוליפרופילן. העבירו את התאים שנאספו דרך המסננת באמצעות פיפטה P1000. שטפו את המסננת (שלב 3.6) עם PBS/1% FBS כדי לשחרר את התאים הנותרים ולהעביר אותם לצינור האיסוף.
- הוסף PBS/1% FBS כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל לכל רשתית. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 7 דקות ב 200 x g ו RT.
הערה: בהתאם למספר הרשתית המקרטעת (< 6 רשתיות), גלולת התא עשויה להיות קטנה מכדי להיות גלויה.
- יש להשליך את הסופרנאטנט של התא ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-PBS/1% FBS ביחס של 1 מ"ל לכל 5 רשתית.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- נקו המוציטומטר מזכוכית וכסו אותו ב-70% אלכוהול. סובב בעדינות את הצינור המכיל את התאים כדי להבטיח שתרחיף תאי הרשתית מפוזר באופן שווה. מניחים 20 μL של 0.4% טריפאן כחול בצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבבים עם 20 μL של תרחיף התא.
- יש לערבב בעדינות ולמרוח 10 μL של תערובת תרחיף טריפאן כחול/תאים 0.4% על ההמוציטומטר, תוך מילוי שני התאים; פעולה נימית תמשוך את תערובת התרחיף של 0.4% טריפאן כחול/תאים מתחת לכיסוי. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את כל התאים הכחולים-שליליים טריפאן; מספר זה מייצג את התאים החיים.
- קבע את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה: ספירת תאים חיה / ספירת תאים כוללת = % viability.
הערה: אם הכדאיות של התאים נמוכה מ-95%, נדרש צבע פלואורסצנטי כדי להבחין בכדאיות התא במהלך מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
- השתמשו בצבע פלואורסצנטי שאינו מיועד לתאים חיים. שטפו את התאים עם PBS כדי להסיר עקבות של סרום. הוסף 1 μL של צבע פלואורסצנטי להבחנה בכדאיות התא לכל 5.0 x 106 תאים בנפח סופי של 100-μL. יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות, מוגן מאור. הוסף פי 10 מעוצמת הקול של PBS / 1% FBS. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 x גרם ו- RT.
- במידת הצורך, לדגור על תרחיף התא למשך הלילה ב 4 °C. אם זה נעשה, מלא את צינור ההשעיה של התא בתווך תא עצבי במקום PBS / 1% FBS. מניחים את הצינור אופקית ושומרים אותו על 4°C.
3. תיוג חיסוני של תאי הרשתית
- השתמש בהמרה הבאה כדי לקבוע את נפח הנוגדנים למספר תא: 2 μL של נוגדנים לכל 5.0 x 106 תאים בנפח 100-μL.
- לשטוף את התאים ולתחזק אותם PBS / 1% FBS. קח aliquot קטן של תאים (5.0 x 106 תאים) לשימוש כבקרה שלילית (ללא תווית) בזמן הגדרת המיון.
הערה: בקרה שלילית זו היא קריטית לכיול תקין של ממיין התא.
- כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים לתאים המבטאים את קולטני Fcγ II ו- III, הוסף 1 μL של נוגדן CD16/32 נגד עכבר לכל 1.0 x 106 תאים בנפח סופי של 50-μL באמצעות PBS / 1% FBS. דגירה במשך 10 דקות ב- RT.
- מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לדגימה ומערבבים בעדינות על ידי פיפט. דוגרים במשך 30 דקות בדלי קרח. ודא כי דלי הקרח מכוסה, שכן האור עלול לסכן את הניסוי עקב הלבנה של פלואורופורים מתויגים.
- הכן את קוקטייל הנוגדנים באמצעות הנוגדנים הבאים נגד עכברים המתויגים באופן פלואורסצנטי: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (Phycoerythrin)-Cyanine7, CD15 PE ו- CD57.
לא מתויג
הערה: עבור כל נוגדן, השתמש בריכוזים הבאים לכל 5.0 x 106 תאים: CD90.2 AF700, 1 מיקרוגרם; CD48 PE-ציאנין7, 0.4 מיקרוגרם; CD15 PE, 0.02 מיקרוגרם; ו-CD57 לא מתויג, 0.4 מיקרוגרם.
- השתמש באמצעי אחסון לפי החישובים הבאים (בהתבסס על הנוגדנים הזמינים מסחרית המפורטים בטבלת החומרים): סה"כ 5.0 x 107 תאים שיש לתייג; 2 μL לכל 5.0 x 106 תאים = 20 μL של כל נוגדן; 4 נוגדנים שונים = 80 μL של קוקטייל נוגדנים; נפח סופי = [(5.0 x 107 תאים סה"כ)/5.0 x 106 תאים] x 100 = 1,000 μL; 80 μL ABS + 50 μL של CD16/32 נגד עכבר + 870 μL PBS / 1% FBS = 1,000 μL.
הערה: שילוב זה סיפק את השילוב האופטימלי של פלואורוכרומים לתצורת המכשיר. הפרמטרים הבאים מסכמים את הפליטה והעירור: AF-700, פליטה של 719 ננומטר כאשר מתרגשים עם לייזר דיודה אדומה 638 ננומטר; PE-ציאנין7, פליטה של 767 ננומטר כאשר הוא נרגש עם לייזר דיודה כחולה 488 ננומטר; ו-PE, פליטה של 575 ננומטר כאשר מתרגשים באמצעות לייזר דיודה כחולה 488 ננומטר.
- לאחר הדגירה של 30 דקות, יש להעלות את עוצמת הקול ל-5 מ"ל באמצעות PBS/1% FBS. לשטוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה אותם במשך 7 דקות ב 200 x גרם RT. חזור על ההליך פעם אחת כדי להסיר את כל הנוגדנים שאינם קשורים.
- הוסף 2 μL של נוגדן משני (0.1 מיקרוגרם), אשר יקשור את CD57 של 5.0 x 106 תאים. דגרו במשך 30 דקות בדלי קרח, כמו בשלב 3.4. שטפו את התאים פעמיים, כמו בשלב 3.5.
- תייג את התאים עם נוגדן משני אם נעשה שימוש בנוגדן ראשוני לא מתויג בשלב 3.4.
הערה: הנוגדן המשני המועדף עבור תצורה זו מופיע בטבלת החומרים; יש לו אורך גל פליטה של 421 ננומטר. השתמש בו עם מסנן פסים של 450/50 ננומטר כאשר אתה נרגש עם לייזר דיודה סגולה ב 405 ננומטר.
- השתמש באמצעי אחסון לפי החישובים הבאים (בהתבסס על הנוגדן הזמין מסחרית המפורט בטבלת החומרים): 2 μL לכל 5.0 x 106 תאים = 20 μL של נוגדן משני; נפח סופי = [(5.0 x 107 תאים סה"כ)/5.0 x 106 תאים] x 50 = 500 μL; 20 μL של ABS + 480 μL PBS / 1% FBS = 500 μL.
- שמור את התאים המסומנים ב- PBS/1% FBS. לספור את התאים באמצעות hemocytometer; השתמש בריכוז סופי של תאי רשתית של 3.0 - 4.0 x 107 תאים/mL.
הערה: אין להשתמש בתווך תרבית תאים כדי לדלל את התאים מכיוון שהפנול האדום יכול להגביר את האוטופלואורסצנטיות, ובכך להפחית את הרזולוציה בין תאים שליליים וחיוביים. ריכוז התא הסופי לנפח תלוי מאוד בקצב זרימת הנפח של תצורת המכשיר.
- השתמש בפקדים בצבע יחיד במהלך ההתקנה כדי למזער את זליגת הפלואורסצנטיות.
הערה: שלב זה, הידוע גם בשם פיצוי, מוחל כדי לתקן את הרעש שנוצר על ידי שילוב של fluorophores. מיקרוספרות פוליסטירן ב- PBS/0.1% BSA/2 mM NaN3 עם היכולת לקשור איזוטיפים של אימונוגלובולינים מתויגים פלואורסצנטית (Ig) ממינים מרובים מספקים בקרות חיוביות לקביעת הפיצוי.
- יש לטפטף 3 טיפות של מיקרוספרות הפוליסטירן לתוך צינורות FACS סטריליים, ולהקצות אחת לכל פלואורופור. הוסף 1 מיקרוגרם של פלואורופור המתאים לכל צינור. יש לדגור במשך 15 דקות ב-RT, מוגן מאור. הוסף 3 מ"ל PBS / 1% FBS לצינורות הדגימה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 x גרם RT. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend ב 250 μL של PBS / 1% FBS.
- כדי להגדיר את הפקדים השליליים, השתמש במיקרוספרות פוליסטירן שאינן נקשרות ל- Ig. במידת הצורך, בצע שלב זה יום לפני.