$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
הערה: בקצרה, פיברובלסטים תוכנתו מחדש ל-iPSC באמצעות תכנות מחדש גנטי מבוסס mRNA. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נשמרו בתווך תאי גזע (SCM) (ראה רשימת חומרים) ואוחסנו בצפיפות של ~1.2 x 102 תאים/מ"ל עם 1 מ"ל SCM, 10 מיקרומטר עם מעכב קינאז חלבון הקשור ל-RHO (ROCKi) Y-27632, ו-10% (v/v) דימתיל סולפיד (DMSO), בבקבוקונים שמורים בהקפאה בחנקן נוזלי בטמפרטורה של -160°C. כל ההליכים הבאים להלן מבוצעים בארון בטיחות ביולוגית, אלא אם צוין אחרת.
1. דילול מטריצת קרום מרתף וציפוי פלטה
- גורם גדילה מדולל (1:50) מטריצת קרום מרתף מופחתת מטוהרת מגידול Engelbreth-Holm-Swarm במדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) ללא אדום פנול.
- לצפות לוחות תרבית תאים עם כמות מתאימה של מטריצת קרום מרתף מדולל (כלומר, צלחת 6 באר = 1mL, צלחת 12 באר = 0.5 מ"ל) ולדגור לוחות אלה ב 37 ° C לפחות 1 שעה.
2. תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC)
הערה: המפגש המרבי לכל באר בלוח שטוח בעל 6 בארות הוא ~ 1.2 x 106 תאים.
- הפשירו iPSCs שמורים בהקפאה לתוך SCM עם 10 μM Y-27632 וצלחת על צלחת 6 בארות מצופה גורם גדילה מדולל מופחת ממברנת מרתף מטריצה.
- שמור על iPSCs ב- SCM עם 10 מיקרומטר Y-27632 במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההפשרה. יש לעבור למדיום טרי לאחר 24 שעות.
- שמרו על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ב-SCM עד שהתאים יגיעו למפגש של 80-90% לפני המעבר.
- חשב כמה iPSCs יידרשו להתמיינות על ידי הכפלת הצפיפות הרצויה להתמיינות (15,600 תאים לסמ"ר) בשטח הפנים של הבאר. עבור צלחת שטוחה בעלת 6 בארות, הכפילו 15,600 תאים/ס"מ2 על 9.6 ס"מ2 ובסך הכל 149,760 תאים/באר.
- כדי לעבור, שטפו את התאים בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBBS). לאחר מכן, לדגור על התאים עם חומצה ethylenediaminetetraacetic לא אנזימטית (EDTA) (ראה רשימת חומרים) במשך 5 דקות ב 37 ° C.
- השתמש במגרד תאים כדי להרים בעדינות את התאים. אסוף תאים ב- SCM טרי.
- יש לחבר תאי צלחת על לוחות תרבית תאים המצופים ב-SCM מדולל ולשמור על תאים כמתואר בשלב 2.3 או לאחסן אותם ב~1.2 x 106 תאים/מ"ל ב-1 מ"ל SCM, 10 מיקרומטר Y-27632 ו-10% DMSO (v/v) בבקבוקונים שמורים בהקפאה בחנקן נוזלי בטמפרטורה של -160°C.
3. הבחנה בין iPSCs ל- BMECs
הערה: EDTA לא אנזימטי מפריד תאים לגושים. EDTA אנזימטי (ראו טבלת חומרים) מפריד תאים לתרחיף של תא בודד. חומצה רטינואית (RA) צריכה להיות מוגנת מפני אור.
- שטפו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים פעם אחת עם מלח חיץ פוספטים (DPBS) של Dulbecco. דגרו עם EDTA אנזימטי (1 מ"ל עבור צלחת 6 בארות, 0.5 מ"ל עבור צלחת 12 בארות, ו 0.25 מ"ל עבור צלחת 24 בארות) במשך כ 5 דקות ב 37 ° C כדי להניב תרחיף תא יחיד.
- לאסוף תאים וצנטריפוגות ב 300 x g (כוח צנטריפוגלי יחסי) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כדורי תא השהיה מחדש ב- SCM המכילים 10 מיקרומטר Y-27632.
- קבע את צפיפות התאים באמצעות Trypan Blue ומונה תאים אוטומטי או התקן המוציטומטר. תאי לוח בצפיפות של 15,600 תאים/ס"מ2 או 149,760 תאים/באר של לוח בעל 6 בארות בעלות תחתית שטוחה (עם שטח פנים של 9.6 סמ"ר/באר) ב-SCM המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 למשך 24 שעות.
- התחל בידול לאחר 24 שעות על-ידי שינוי SCM למדיום E6. שנה E6 בינוני מדי יום במשך 4 הימים הבאים.
- ביום הרביעי להתמיינות, יש להחליף את מדיום E6 בתווך נטול סרום אנדותל אנושי (hESFM) בתוספת תוסף B27 מדולל (1:200), גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) של 20 ננוגרם/מ"ל ו-RA של 10 מיקרומטר. אל תשנה מדיום זה במשך 48 השעות הבאות.
- הכינו 200 מ"ל של hESFM עם B27 מדולל (1:200), ערבבו 1 מ"ל של תוסף B27 מרוכז פי 50 ל-199 מ"ל של hESFM.
- הכן 20 ng/mL של bFGF על ידי הרכבה מחדש של 50 מיקרוגרם של bFGF ב 250 μL של מאגר Tris (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mMsodium chloride, NaCl) כדי ליצור 200 מיקרוגרם / מ"ל תמיסת מלאי. הכינו 200 מ"ל של hESFM המכיל 20 ננוגרם/מ"ל bFGF על ידי ערבוב 20 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם/מ"ל bFGF עם 200 מ"ל של hESFM.
- הכן 10 מיקרומטר RA על ידי ביצוע תחילה 40 מ"ג / מ"ל של תמיסת מלאי RA על ידי הוספת 2.5 מ"ל של DMSO ל 100 מ"ג של אבקת RA. דללו ריכוז זה ל-3 מ"ג/מ"ל כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מילימול. הכינו 200 מ"ל של hESFM המכיל 10 μM RA על ידי ערבוב 200 μL של 10μM RA ב-200 מ"ל hESFM.
4. ציפוי קולגן IV (COL4) ומטריצת פיברונקטין (FN) לטיהור BMEC הנגזר מ-iPSC
- הוסף 2 מ"ל מים סטריליים ל -2 מ"ג FN כדי ליצור 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי FN. הוסף 5 מ"ל מים סטריליים ל-5 מ"ג של COL4 כדי ליצור תמיסת מלאי COL4 של 1 מ"ג/מ"ל.
- אפשר ל-FN להתמוסס למשך 30 דקות לפחות ב-37°C ול-COL4 להתמוסס בטמפרטורת החדר.
- יש לדלל את תמיסת מלאי FN במים סטריליים לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל ואת תמיסת מלאי COL4 לריכוז סופי של 400 מק"ג/מ"ל.
- צפו את הצלחות הרצויות (צלחת 6 בארות = 1 מ"ל של תמיסת COL4/FN, צלחת 12 בארות = 0.5 מ"ל, צלחת 24 באר = 0.25 מ"ל, וצלחת מסוננת 12 טרנסוול = 0.25 מ"ל) בתערובת של 400 מיקרוגרם / מ"ל COL4 ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל FN.
- יש לדגור על צלחות למשך שעתיים לפחות או ללילה בטמפרטורה של 37°C; עבור צלחות מסוננות Transwell, מומלץ לפחות 4 שעות.
5. תת-תרבות וטיהור של BMECs שמקורם ב-iPSC
הערה: הדגירה עם EDTA אנזימטי עשויה להימשך יותר מ-15 דקות, תלוי במפגש התאים ביום 6 להתמיינות.
- ביום 6 להתמיינות, יש לשטוף תאים פעמיים עם DPBS. יש לדגור עם 1 מ"ל של EDTA אנזימטי למשך 15 דקות לפחות ב-37°C עד לקבלת תרחיף של תא בודד.
- לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כדורי תא השהיה מחדש עם hESFM טרי עם תוספת B27 מדוללת (1:200), 20 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר RA.
- תאי זרעים על צלחות מצופות בתערובת של 400 מיקרוגרם/מ"ל COL4 ו-100 מיקרוגרם/מ"ל FN. תאי זרעים המשתמשים ביחס של באר אחת של צלחת 6 בארות ל-3 בארות של צלחת בת 12 בארות, 3 בארות של צלחת מסוננת של 12 בארות, או 6 בארות של צלחת של 24 בארות.