$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הגדרת חומרים
- יש לדגור על ביצי אפרוחים באינקובטור ביצים שולחני זמין מסחרית בטמפרטורה של 37°C. לדגור על ביצים במשך 7 ימים עבור עוברי E7.
- הכן מערכים מרובי אלקטרודות (MEAs). לעקר את המספר הנדרש של MEAs על ידי השרייתם באתנול 70% למשך 3 עד 4 שעות ולאחר מכן שטיפתם שלוש פעמים בכ -10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים במכסה המנוע ברמת בטיחות ביולוגית II (BSLII).
הערה: MEAs מכילים 64 אלקטרודות פלטינה ננו-נקבוביות המסודרות ברשת 8 x 8. קוטר האלקטרודה הוא 30 מיקרומטר, והמרווח בין האלקטרודות הוא 200 מיקרומטר. אין להשתמש אתנול deproductd כדי לעקר MEAs, כמו זה יוביל קורוזיה.
- מניחים את MEAs בתוך מיכל סטרילי עם מכסה (כדי לשמור על תנאים סטריליים) ועוברים לאינקובטור שולחני. אופים לפחות 6 שעות ב 55 מעלות צלזיוס. שלב זה הוא קריטי לעיקור נכון, והטמפרטורה לא תעלה על 60 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על סטריליות, העבר את הצלחת המכילה MEAs למכסה המנוע BSLII לאחסון עד לשימוש נוסף.
הערה: אנו משתמשים בתבנית אפייה מזכוכית בטוחה לתנור עם מכסה פלסטיק ומחטאים אותה עם אתנול 70% ומניחים אותה בקולט האדים BSLII לייבוש.
- Aliquot פתרון מטריצה חוץ-תאית (ECM). הפשירו את הבקבוקון ב 4 °C למשך הלילה והקפיאו 100 μL aliquots ב -20 °C.
הערה: ECM נשלח קפוא. אין להביא אותו לטמפרטורת החדר עד שהוא מוכן לציפוי מכיוון שהוא מתפלמר בטמפרטורת החדר ואי אפשר לצפות אותו לאחר פילמור. ECM ללא גורמי גדילה עדיף למנוע השפעות נוספות עקב גורמים לא ידועים.
- יש לעקר את כל מכשירי הדיסקציה (מלקחיים מסוג Dumont #5, מלקחיים מעוקלים, מספריים קטנים ומספריים קפיציים) וכלי דיסקציה מצופים חומר באיטום עצמי עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש במכסה המנוע.
2. תרבות נוירון עוברי אפרוח ופעילות ברשת
- ביום הציפוי, הוציאו בקבוקון של ECM מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C, רססו באתנול 70% והניחו אותו על קרח. לדלל עד 25% על ידי הוספת 300 μL מדיום נוירובזאלי קר בתוך מכסה המנוע BSLII.
- באמצעות פיפטמן P200 להוסיף 100 μL של 25% ECM למרכז MEA תוך הקפדה לא לגעת באלקטרודות ולהסיר מיד משאיר סרט דק על פני השטח. מכסים את MEA ומניחים באינקובטור CO2 (37° C ו-5% CO2) עד שהם מוכנים לצלחת את הנוירונים.
- לעקר את הקליפה החיצונית של ביצית E7 (יום עוברי 7, מודגר ב 37 ° C במשך 7 ימים) עם 70% אתנול. ערפו את ראשו של העובר לתוך צלחת דיסקציה תחתונה של סילגארד המכילה תמיסת מלחים מאוזנים קרים וסטריליים של האנק (HBSS) ללא סידן. חותכים סביב העיניים ומסירים את גלגלי העיניים. באמצעות DuMont #5 מלקחיים עדינים ומספריים קפיציים לבצע חתך בצד הגחון ולהסיר את שכבות העור החיצוניות כדי לחשוף את המוח הקדמי ואת טקטום אופטי. מקלפים ומסירים את קרום הפיאל בזהירות. מעבירים את המוח הקדמי לצלחת פטרי אחרת וחותכים אותו לחתיכות קטנות של כ-2 מ"מ בעזרת מספריים קפיציים.
הערה: לא צריך להיות כל כלי דם מחובר למוח הקדמי לאחר הסרת קרום pial. אם זמין, עדיף לבצע את הדיסקציה במכסה מנוע סטרילי, אם כי השגנו תוצאות טובות למדי כאשר הדיסקציה מבוצעת מחוץ למכסה המנוע כל עוד המכשירים ואזור הדיסקציה מעוקרים היטב עם 70% אתנול.
- בעזרת פיפטת העברה סטרילית, אספו את חתיכות המוח הקדמי לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל והוציאו כמה שיותר מה-HBSS לאחר שנתנו להן לשקוע לתחתית צינור הצנטריפוגה.
- יש להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/אתילאנדיאמין חומצה טטראצטית (טריפסין/EDTA) (מחומם מראש ל-37°C) ולדגור ב-37°C למשך 15 דקות.
- באמצעות פיפטה פסטר, בזהירות להסיר טריפסין מבלי להפריע חתיכות של רקמה ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום neurobasal. תן לחתיכות הרקמה לשקוע לתחתית ולהסיר את המדיום. חזור על שטיפה זו פעם נוספת. שלב זה הוא לשטוף את טריפסין/EDTA.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום neurobasal ולהתחיל trituating. טריטורציה כוללת לקיחת פיפטה סטרילית של פסטר מלוטשת באש והעברה עדינה של הרקמה דרכה מספר פעמים עד שלא רואים חתיכות נוספות. אם חלקים כלשהם נשארים לאחר מעברים חוזרים ונשנים, פשוט השאירו אותם להתיישב לתחתית.
הערה: הימנעו מהקצפה בזמן ההקצפה - אם אכן נוצר קצף, הפסיקו והסירו בשאיפה.
- לדלל את התאים המרחפים מחדש 1:10 עם תווך נוירובזאלי ולספור תאים קיימא באמצעות צבע כחול טריפאן והמוציטומטר. מערבבים 50 μL של התאים המדוללים עם 50 μL של תמיסת Trypan Blue בצינור צנטריפוגה 0.5 מ"ל. הוסף 10 μL להמציטומטר לאחר הנחתו על הכיסוי וספור את התאים השקופים הבהירים (תאים כחולים מתים ואין לספור אותם).
הערה: מספרי תאים אופייניים מטקטום אופטי E7 יחיד נעים בין 1 ל 5 x 107 תאים / מ"ל.
- לוחית את התאים המנותקים על MEAs מצופים ECM בצפיפות של 2,200 תאים / מ"מ מרובע. עבור מערכת MEA שלנו, זה מתורגם לכ -130,000 תאים לכל MEA. הוסף את המדיום הנוירו-בסיסי כדי להביא את הנפח ב-MEA ל-1 מ"ל ומקם MEAs באינקובטור CO2 למשך הלילה עבור חיבור תאים והרחבת נוירוריט (איור 1).
הערה: עבור MEAs של אזורים שונים ומספרי אלקטרודות שונים, ניתן לנסות צפיפויות תאים שונות - באופן כללי, צפיפות תאים גבוהה יותר גורמת לפעילות רשת גדולה יותר, אך גם מובילה לתרביות קצרות יותר.
