יצירת שבב מחסום דם-מוח באמצעות תאים מקדימים שמקורם ב-iPSC

תקציר

מקור: Jagadeesan, S., et al., דור של שבב מחסום דם-מוח מבוסס iPSC אנושי. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מציג יצירת שבב מחסום דם-מוח באמצעות תאים מקדימים שמקורם ב-iPSC. זה כרוך בזריעת תאי אב עצביים ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח בתעלות נפרדות עם קרום נקבובי. על ידי זרימת אמצעי התמיינות תאי האנדותל יוצרים צמתים הדוקים הדומים לכלי דם, והתאים העצביים מבשילים לסוגים שונים של תאי מוח, ויוצרים מחסום דם-מוח תפקודי על השבב.

פרוטוקול

1. יצירת תאי אב עצביים שמקורם ב-iPSC (iNPCs)

1. הפק כדורי EZ ממושבות iPSC כמתואר להלן וכפי שפורסם בעבר.
   1. תרבות מושבות iPSC למפגש על 6 צלחות באר מצופות ממברנת מרתף (0.5 מ"ג/צלחת) ב-mTESR1 או במדיה מסחרית אחרת (ראה טבלת חומרים).
   2. הסר את מדיום iPSC והחלף ב- 2 מ"ל של מדיום EZ-sphere [ESM; DMEM:F12 7:3 בתוספת גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי של 100 ננוגרם/מ"ל (bFGF), גורם גדילה אפידרמלי של 100 ננוגרם/מ"ל, הפרין של 5 מיקרוגרם/מ"ל ותוספת B27 של 2%.
   3. לגרד את החלק התחתון של כל באר מפגש עם הגב של קצה פיפטה סטרילי 1000 μL או מגרד תאים.
   4. אספו את כל התאים והניחו אותם בבקבוק חיבור T25 נמוך במיוחד כדי לאפשר היווצרות ספונטנית של כדורים צפים חופשיים. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F).
   5. האכילו את הכדורים כל 2-3 ימים כאשר התווך הופך צהוב על ידי החלפת מחצית התווך ב- ESM טרי. זה מאפשר לספירות להישאר בתווך מותנה, שהוא חשוב מאוד לצמיחתן ותחזוקתן.
      1. השעינו את הבקבוק על מתלה צינור ואפשרו לכדורים לשקוע על ידי כוח הכבידה למשך 1-2 דקות עד לפינת הצלוחית.
      2. לאחר ההתיישבות, שאפו מחצית מהסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל או 10 מ"ל והחליפו אותה ב-ESM טרי שחומם מראש.
   6. מעבר לכדורי EZ שבועיים על ידי חיתוך כדורים לקוטר 200 מיקרומטר כפי שתואר קודם לכן. ניתן לשמור על כדורי EZ עד 25 מעברים והם אידיאליים כאשר משתמשים בהם בין מעברים 8-25.
2. הכן השעיה חד-תאית של iNPCs:
   1. כדי לגרום להתמיינות עצבית, נתקו את כדור ה-EZ לתאים בודדים.
   2. לאסוף כדורים 3-4 ימים לאחר קיצוץ מבקבוק T75 ולהעביר אותם לתוך חרוט 15 מ"ל, ולאחר מכן לתת לו לעמוד במשך 2 דקות או עד שכל הכדורים מתיישבים בתחתית.
   3. הסר לאט ESM עם פיפטה 5 מ"ל מבלי להפריע לכדורים המיושבים. הוסף 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) ודגר במשך 10 דקות ב 37 ° C.
   4. מערבלים את תמיסת הדיסוציאציה והכדורים לאחר 5 דקות של דגירה כדי להבטיח שכל הכדורים המיושבים מטופלים.
   5. הסר לאט את פתרון הדיסוציאציה. הוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות עצבית [NDM; DMEM: F12 עם 2% B27 פחות ויטמין A, תוסף N2 1% וגורם נוירוטרופי שמקורו במוח אנושי (hBDNF, 20 ng/mL)].
   6. טריטורציה של הכדורים לתאים בודדים על ידי פיפטה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל ואחריה פיפטה של 200 מיקרוליטר, עד שכל הכדורים התנתקו. הימנע היווצרות בועות במהלך הליך trituration.
   7. ספירת תאים מנותקים באמצעות המוציטומטר ודלול תאים לצפיפות סופית של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל. ניתן לשנות את הצפיפות בהתאם ליישום.
      הערה: צפיפות גבוהה יותר (עד 6 x 10⁶ תאים / מ"ל) מומלצת לתרביות לטווח קצר של עד 3 ימים, וצפיפויות נמוכות יותר מומלצות ליישומים ארוכי טווח של עד 3 שבועות.
      הערה: תאים מוכנים כעת לזרוע לתוך הערוץ העליון של השבב כדי ליצור את "צד המוח".

2. הבחנה של iPSCs לתוך iBMECs

1. מעבר iPSCs מבאר מפגש אחת של צלחת 6 בארות ביחס של 1:6 לתוך צלחת ממברנה מרתף 6 בארות מצופה מטריצה. תן לתאים להיצמד במשך 24 שעות. שנה את מדיום iPSC מדי יום.
2. לספור תאים מדי יום באמצעות המוציטומטר.
3. כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 1.5-3.0 x 105 תאים/באר, יש להחליף את מדיום iPSC ב-3 מ"ל של תווך לא מותנה ללא bFGF [DMEM:F12 1:1, עם 10% החלפת סרום נוקאאוט (KOSR), 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.5% תוסף גלוטמין (טבלה של חומרים) ו-100 מיקרומטר β-מרקפטואתנול]. יש להחליף את המוצר הבינוני מדי יום למשך 6 ימים.
4. ביום 6, יש להחליף את המדיום במדיום תאי אנדותל (EC) [מדיום נטול סרום אנדותל אנושי (hESFM) בתוספת סרום בקר 1% דל טסיות דם, 20 ng/mL bFGF ו-10 μM all-trans retinoic acid (RA)]. להשאיר בינוני במשך 2 ימים.
5. הסר מדיום EC והוסף 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 35 דקות
   הערה: בעוד שזה נחשב זמן דגירה ארוך בתמיסת הדיסוציאציה המשמשת כאן, iBMECs יכולים לסבול את הטיפול הזה עם כדאיות התא גבוהה מ -90%.
6. נתק את התאים מהבאר על ידי צנרת עדינה של תרחיף התא ואיסוף כל התאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
   הערה: הימנע pipetting קשה. אם התאים אינם מתנתקים בקלות, יש לדגור במשך 5 דקות נוספות.
7. הוסף נפח אחד של מדיום EC לחרוט 15 מ"ל כדי להשבית Accutase, צנטריפוגה ב 200 x g למשך 5 דקות, להסיר את המדיום, ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום EC (ללא bFGF ו RA).
8. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר והתאם את צפיפות התאים ל 14-20 x 10⁶ תאים/mL.
   הערה: תאים מוכנים כעת להיזרע לתוך הערוץ התחתון של השבב כדי ליצור את "צד הדם".

3. מיקרו-פבריקציה של שבב האיבר

1. השתמש בשבב איברים עבור דגם שבב BBB וייצורו כפי שנעשה בעבר. שבב האיבר בעל התעלה הגבוהה (ראו טבלת חומרים) מיוצר מאלסטומר פולידימתילסילוקסאן גמיש במיוחד (PDMS) המכיל שתי תעלות מיקרו-סקאלה מונחות ומקבילות המופרדות על ידי קרום נקבובי גמיש. גדלי המיקרו-ערוצים העליונים והתחתונים הם 1 מ"מ x 1 מ"מ ו- 1.0 מ"מ x 0.2 מ"מ, בהתאמה. שתי התעלות מופרדות על ידי קרום נקבובי גמיש מתוצרת PDMS בעובי 50 מיקרומטר, המכיל נקבוביות בקוטר 7 מיקרומטר עם מרווח של 40 מיקרומטר. שטח הפנים של הקרום הנקבובי המפריד בין התעלות הוא 0.171 ס"מ².

4. הכנת שבב

1. שבבי איברים מסופקים ארוזים מראש בתוך ספק השבב, ומבטלים את הצורך להפריע או לעוות את יישור השבב במהלך הטיפול. בנוסף, ספק השבב מתחבר בצורה מאובטחת למודול נייד ("פוד") המשמש כממשק בין מודול התרבות לשבב.
   1. רססו את אריזות השבבים באתנול 70% והכניסו אותם לארון הבטיחות הביולוגית (BSC).
   2. פתחו את האריזה והניחו את שבב האיברים בצלחת פטרי סטרילית. טפל במוביל השבב רק בצדדים כדי למנוע מגע ישיר עם השבב.
   3. ודאו שהלשונית של המפעיל פונה ימינה (איור 1), וכשאתם משתמשים בשבבים מרובים, ישרו את כולם באותו כיוון.
   4. תייגו כל שבב בכרטיסיית הספק (הכנה מלאה של השבב וזרימת העבודה מוצגים באיור 2).

5. הפעלת פני השטח וציפוי ECM

1. הכנת פתרון הפעלת פני השטח
   1. מגיב חיקוי 1 (ER-1), המסופק בבקבוקון המכיל 5 מ"ג, רגיש לאור. יש להכין תמיסת ER-1 טרייה מיד לפני השימוש. שלמות ER-1 חיונית בהכנה מוצלחת של השבבים.
   2. כבה את האור ב- BSC בעת טיפול ב- ER-1.
      הערה: ER-1 הוא מגרה עיניים ויש לטפל בו ב- BSC עם כפפות מתאימות והגנה על העיניים.
   3. אפשר לריאגנטים ER-1 ו-ER-2 להתאזן לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
   4. הגן על התמיסה מפני אור על ידי עטיפת צינור חרוטי סטרילי ריק 15 מ"ל עם נייר כסף.
   5. ב-BSC, יש לטפוח בקצרה על בקבוקון ER-1 כדי ליישב את האבקה בתחתית.
   6. הוסף 1 מ"ל של חיץ ER-2 לבקבוקון, ומיד להעביר את התוכן שלה לתחתית של צינור חרוט עטוף 15 מ"ל. אין לערבב פיפטה. צבע התמיסה המועברת לצינור החרוטי יהיה אדום.
   7. חזור על שלב 5.1.6 3x. בסבב האחרון, מכסים את בקבוקון ER-1 והופכים כדי לאסוף את האבקה שנותרה מהמכסה, ואז מעבירים את התמיסה לצינור החרוט; זה יביא את הנפח הכולל ל 4 מ"ל של פתרון ER-1.
   8. הוסף 6 מ"ל של תמיסת ER-2 ל- 4 מ"ל של תמיסת ER-1 בצינור החרוטי של 15 מ"ל לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל. ER-1 צריך להיות מומס לחלוטין בתוך פתרון ER-2.
2. הפעלת פני השטח
   1. באמצעות פיפטה P200 וקצה פיפטה סטרילי מסונן 200 μL, לקחת 200 μL של תערובת ER-1.
   2. מניחים את הפיפטה בפתח התחתון ודוחפים 20 μL של תערובת ER-1 דרך התעלה התחתונה עד שהתערובת מתחילה לזרום החוצה משקע התעלה התחתונה.
   3. הוסיפו כ-50 μL של תערובת ER-1 והניחו אותה בפתח התעלה העליון. דחפו את התערובת דרך הערוץ העליון עד שהיא מתחילה לזרום החוצה משקע הערוץ העליון.
   4. הסר את כל תערובת ER-1 העודפת מפני השטח של השבב על ידי שאיפה עדינה. ודא שתערובת ER-1 מוסרת רק משטח השבב ולא מהתעלות.
   5. ודא שהתעלות נקיות מבועות אוויר לפני הפעלת אולטרה סגול (UV). אם מזוהות בועות אוויר, הסירו את הבועות על ידי שטיפת התעלה בתערובת ER-1.
   6. הכניסו את הצלחת הפתוחה המכילה את הצ'יפס לקופסת האור UV (מסופקת על ידי Emulate Inc).
   7. הגדר את המתג בחלק האחורי של תיבת תאורת ה- UV להגדרה "עקבי". הפעל את החשמל והתחל הפעלת UV. השאר את השבבים תחת אור UV למשך 20 דקות.
      הערה: יש להימנע מחשיפת אנשי צוות לאור UV.
   8. הסר את תערובת ER-1 משני הערוצים.
   9. שטפו כל תעלה בתמיסת ER-2 בנפח 200 מיקרוליטר
   .
   10. הסר את ER-2 משני הערוצים.
   11. יש לשטוף כל תעלה במי מלח קרים סטריליים (DPBS) של Dulbecco.
   12. השאר DPBS קרים בתוך הערוצים עד שתמשיך לשלב הבא.
3. הכנה וציפוי מטריצה חוץ-תאית (ECM)
   1. הכן את פתרון ה- ECM על-ידי שילוב רכיבי ECM בודדים עם DPBS קר, מים או ממס אחר לריכוזי העבודה הסופיים. פתרון ECM צריך להיות מוכן טרי בכל פעם שהוא משמש.
   2. צפה את שני הערוצים העליונים והתחתונים של השבב עם ECM, עם הרכב כפי שנקבע על ידי סוג התא להיות זרע. תערובת ECM חייבת להישמר על קרח עד לשימוש.
   3. השתמש בלמינין (50 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לצפות את "צד המוח", וקולגן IV ופיברונקטין מעורבבים ביחס של 4:1 (320:80 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לצפות את "צד הדם" כמתואר בסעיף 5.6.
4. הכנת aliquots ECM
   1. לדלל 1 מ"ג/מ"ל למינין ב-DPBS קר לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
   2. ממיסים קולגן IV ב-0.1% חומצה אצטית לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. יש לדגור על התמיסה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב-RT למשך 1-3 שעות או עד להמסה מלאה.
   3. הכינו תערובת של 1 מ"ל קולגן IV:פיברונקטין (320 מיקרוליטר קולגן IV, 80 מיקרוליטר פיברונקטין ו600 מיקרוליטר H2O סטרילי מזוקק כפול). ניתן לאחסן את התערובת ב -20 מעלות צלזיוס.
5. ציפוי השבבים עם ECM
   1. שאפו באופן מלא את ה-DPBS הקר משני הערוצים. הגדר פיפטה P200 לקחת 100 μL של קולגן IV:תמיסת פיברונקטין .
   2. הציגו את התמיסה דרך פתח הערוץ התחתון עד שתיווצר טיפה קטנה על השקע. השאירו טיפה קטנה על הכניסה לאחר הסרת קצה הפיפטה.
   3. הציגו את תמיסת הלמינין דרך פתח הערוץ העליון עד להיווצרות טיפה קטנה על השקע. השאירו טיפה קטנה על הכניסה לאחר הסרת קצה הפיפטה.
   4. התבונן היטב בערוצים כדי לוודא שאין בועות. אם קיימות בועות, שטפו את התעלה בתמיסת ECM המתאימה עד להסרת כל הבועות.
   5. חזור על שלבים 5.5.1–5.5.4 עבור כל שבב.
   6. הוסף 1.5 מ"ל של DPBS למכסה של צינור חרוטי 15 מ"ל. הניחו את פקק ה-DPBS בצלחת תרבית בקוטר 150 מ"מ עם הצ'יפס כדי לספק לחות נוספת ולאטום את המנה בפרפילם. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לדגור על השבבים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
      הערה: אם רוצים, ניתן לזרוע תאים באותו יום כמו הפעלת שבב וציפוי ECM, אם כי דגירה לילה עדיפה. שבבים יכולים להיות מוכנים לזריעה 4 שעות לאחר הוספת ECM ודגירת שבבים ב 37 מעלות צלזיוס.

6. זריעת ערוץ "צד המוח" והבחנה של כדורי EZ לתרבויות עצביות מעורבות

1. הביאו את המנה המכילה את הצ'יפס המוכן ל- BSC. שטפו בעדינות את שני הערוצים עם 200 μL של NDM.
2. הימנעות ממגע עם היציאות, בזהירות לשאוף טיפות מדיה עודפות מפני השטח של השבב. יש להסעיר בעדינות את תרחיף התאים לפני הזריעה של כל שבב כדי להבטיח תרחיף תאים הומוגני
3. זריעת iNPCs לתוך הערוץ העליון כדי ליצור את "צד המוח"
   1. זרעו את התאים (1 x 106 תאים / מ"ל) לתוך הערוץ העליון של השבב. הוסף קצה P200 המכיל 30-100 μL של מתלה תאים לפתח התעלה העליונה ושחרר בעדינות את הקצה מהפיפטה. קח פיפטה P200 ריקה, לחץ על הבוכנה, הכנס אותה לשקע הערוץ העליון ומשוך בזהירות את המתלה החד-תאי דרך השבב.
   2. מכסים את הצלחת ומעבירים למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה והפיזור ההומוגני של התאים בתוך הערוץ העליון. הסר בעדינות את קצה פיפטה מכניסת השבב ומיציאות היציאה.
   3. צפיפות הזריעה צריכה להופיע ככיסוי של 20%. אם צפיפות הזריעה גבוהה או נמוכה מהצפוי או לא אחידה, להחזיר את השבבים ל- BSC, לשטוף את הערוץ 2x עם 200 μL של מדיום טרי, ולחזור על שלב 6.3.1.
   4. לאחר אישור צפיפות התא הנכונה, מיד למקם את השבבים באינקובטור במשך 2 שעות ב 37 ° C לאחר זריעת כל אצווה של שבבים. שטפו את התאים שאינם מתחברים עם NDM טרי.
   5. שמור על תאים בתנאים סטטיים בטמפרטורה של 37°C עם החלפת NDM יומית למשך 48 שעות לפחות לפני תחילת הזרימה. ניתן לזרוע iBMEC לאחר חיבור iNPCs או ביום שלאחר מכן לאחר זריעת iNPC.

7. זריעת iBMEC לערוץ התחתון כדי ליצור את "צד הדם"

1. הביאו את המנה המכילה את הצ'יפס המוכן ל- BSC. שטפו בעדינות את התעלה התחתונה עם 200 μL של מדיום EC.
2. הימנעות ממגע עם היציאות, בזהירות לשאוף טיפות של עודף EC בינוני מפני השטח של השבב, הקפד להשאיר בינוני בשני הערוצים. יש להסעיר בעדינות את תרחיף התאים לפני הזריעה של כל שבב כדי להבטיח השעיית תאים הומוגנית.
3. בעזרת פיפטה P200, ציירו 30–100 μL של מתלה תאי iBMEC (14–20 x 10⁶ תאים/מ"ל) והניחו את הקצה בפתח התעלה התחתון. נתקו בעדינות את הקצה מהפיפטה, והשאירו את הקצה המכיל את התא בפתח הכניסה.
4. לחץ על הבוכנה על פיפטה P200 עם קצה ריק, הכנס לשקע הערוץ התחתון ומשוך בזהירות את מתלה התא הבודד דרך התעלה התחתונה על ידי שחרור איטי של בוכנה פיפטה.
5. שאפו עודף השעיית תאים מפני השטח של השבב. הימנע ממגע ישיר עם יציאות הכניסה והיציאה כדי להבטיח שאף מתלה תא לא ייפלט מהתעלות.
6. מכסים את השבב ומעבירים אותו למיקרוסקופ כדי לצפות בצפיפות הזריעה. יש למלא את התעלה התחתונה ללא רווחים נצפים בין תאים כאשר צופים בה במהירות 4x או 10x תחת מיקרוסקופ (איור 3).
7. אם צפיפות הזריעה נמוכה מ-90% כיסוי או שהיא מפוזרת באופן לא אחיד, התאימו את צפיפות התאים בהתאם וחזרו על שלבים 7.2–7.6 עד להשגת הצפיפות הנכונה בתוך הערוץ. לאחר אישור צפיפות התאים הנכונה (איור 3), זרעו תאים בשבבים הנותרים. כדי לחבר תאים לקרום הנקבובי, הממוקם בחלק העליון של התעלה התחתונה, הפוך כל שבב והנח בעריסה שבב.
8. הניחו מאגר קטן (מכסה צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל DPBS סטרילי) בתוך צלחת 150 מ"מ כדי לספק לחות לתאים. לדגור על שבבים בטמפרטורה של 37°C למשך כ-3 שעות, או עד שהתאים בתעלה התחתונה נצמדו. לאחר חיבור iBMEC (~ 3 שעות לאחר הזריעה), הפוך את השבבים בחזרה למצב זקוף כדי לאפשר חיבור תאים לחלק התחתון של הערוץ התחתון.

8. התחלת זרימה

1. הזרימה מתחילה בדרך כלל 48 שעות לאחר הזריעה של iBMECs. זמן זה נדרש עבור iBMECs להתחבר בחוזקה לשבב.
2. כדי לשמור על זרימה למינרית דרך השבב, חשוב degas ולאזן את הטמפרטורה של המדיום. בינוני חייב להיות מחומם מראש באמבט מים 37 °C למשך 1 שעות.
3. עד 50 מ"ל של תווך מחומם ניתן degassed על ידי דגירה תחת מערכת סינון מונע ואקום במשך 15 דקות.
4. פריימינג של מודולים ניידים
   1. יש לחטא את החלק החיצוני של אריזת המודול הנייד והמגשים באתנול 70%, לנגב ולהעביר ל-BSC. פתח את החבילה והנח את המודולים במגש. לכוון אותם עם המאגרים לכיוון החלק האחורי של המגש.
   2. פיפטה 3 מ"ל של מדיה חמה מאוזנת מראש לכל מאגר כניסה. הוסף מדיום תרבות EC למאגר הכניסה של הערוץ התחתון ו- NDM למאגר כניסת הערוץ העליון של הערוץ העליון (איור 4).
   3. פיפטה 300 μL של מדיה חמה ומאוזנת מראש לכל מאגר יציאה, ישירות מעל כל יציאת מוצא (איור 4).
   4. הנח עד שישה מודולים ניידים על כל מגש. הביאו את המגשים לחממה והחליקו אותם לחלוטין לתוך מודול התרבית כשידית המגש פונה כלפי חוץ.
   5. בחר והפעל את מחזור "Prime" במודול התרבות. סגור את דלת האינקובטור ואפשר למודול התרבית להקדים את המודולים הניידים (לוקח ~ 1 דקות). מחזור ההקדמה הושלם כאשר בשורת המצב כתוב "מוכן". הסר את המגש ממודול התרבית והבא אותו ל- BSC.
   6. ודא שהמודולים הניידים הוכנו בהצלחה על-ידי בדיקת החלק התחתון של כל מודול נייד ב- BSC. חפשו נוכחות של טיפות קטנות בכל ארבע היציאות.
      1. אם מודול נייד כלשהו אינו מציג טיפות, הפעל מחדש את מחזור הראשוני במודולים אלה. אם מדיה כלשהי טפטפה על המגש (זה עלול להתרחש לעתים קרובות יותר על ידי יציאות היציאה), יש לנקות את המגש עם 70% אתנול.
5. חיבור שבבים למודולים ניידים, ויסות וייזום זרימה
   1. שטפו בעדינות את שני הערוצים של כל שבב עם מדיום תרבית חם ומאוזן ספציפי לתא כדי להסיר בועות אפשריות בערוץ והניחו טיפות קטנות של מדיה (בהתאם למדיה בערוץ) בחלק העליון של כל פתח כניסה ויציאה.
   2. הכנס שבבים עם ספקים למודולים הניידים והנח עד שישה על כל מגש. הכנס מגשים למודול התרבית. תכנת את תנאי תרבית שבב האיברים המתאימים (קצב זרימה ומתיחה) במודול התרבית.
   3. התנאים המתוכנתים יתחילו ברגע שמחזור "לווסת" יושלם.
      הערה: ניתן לשלוט בקצבי הזרימה של כל ערוץ באופן עצמאי וניתן לכוונם לקצבי זרימה הנעים בין 0-1,000 מיקרוליטר/שעה. שבב BBB הוא בדרך כלל תרבית ב 30 μL / h. כאשר מדיה זורמת כגון מדיה EC או ESM ב 30 μL / h ו 1000 μL / h, כוחות הגזירה הם 0.01 dyn / cm² ו 0.33 dyn / cm², בהתאמה.
   4. הפעל את מחזור "לווסת", שאורך כשעתיים, ולאחר מכן מודול התרבית יתחיל לזרום בתנאי תרבית שבב האיברים שנקבעו מראש.

תוצאות

איור 1: סכמטי של התצוגה העליונה של השבב במוביל השבב, עם יציאות מסומנות.

איור 2: תרשים זרימה של הכנה וזרימת עבודה של שבב BBB מבוסס iPSC. נדרש קדם-התמיינות של תאים עצביים ותאי אנדותל מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לפני תחילת זרימת העבודה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אקוטאזה	EMD Millipore	SCR005	פתרון דיסוציאציה
B27	גיבקו	12587010
Bfgf	פפרוטק	100-18 ב'
שבב-S1	Emulate Inc	שבב-S1	איבר-שבב
קולגן IV	סיגמא	C5533
DMEM: F12	תרמו פישר סיינטיפיק	31330038
חיקוי מגיב 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
חיקוי מגיב 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
פיברונקטין	סיגמא	F1141
גלוטמקס	לייף טכנולוגיות	35050038	תוסף גלוטמין
hBDNF	פפרוטק	450-02
קוסר	תרמו פישר סיינטיפיק	10828028
למינין	סיגמא	L2020
מטריג'ל	קורנינג	354234	מטריצת קרום מרתף
mTeSR1	StemCell טכנולוגיות, Inc.	85851
NEAA	תעשיות ביולוגיות	01-340-1B
נוטריסטם	תעשיות ביולוגיות	05-100-1א	מדיה חלופית
סרום בקר דל טסיות דם שמקורו בפלזמה (PPP)	טכנולוגיות ביו-רפואיות	J64483AB
חומצה רטינואית (RA)	סיגמא	₪625
יחידת מסנן צנטריפוגה סטרילית Steriflip-GP	מיליפור	SCGP00525
β-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	31350010