$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
1. מיקרודיסקציה של טלנספלון דורסולטרלי
- הכנת מדיום הדיסקציה (100 מ"ל): 98.5 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), 0.5 מ"ל 5 מ"ל 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית (HEPES) pH 7.4, 1 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל).
- סנן-עיקור מדיום הדיסקציה.
- הסר עוברי יום 14 (E14) עוברים מעכבר בהריון C57/Bl6 (Mus musculus) תחת הרדמה עם isoflurane.
הערה: שקול E0 כיום זיהוי פקק בנרתיק. יש להשלים את הדיסקציה לא יאוחר משעה לאחר ההסרה מהעכבר ההרה. פרוטוקול זה חל גם על עוברים E11-E17.
- הסר את העוברים על ידי כריתת רחם בתנאים סטריליים.
- מעבירים את העוברים לצלחת פטרי עם תווך דיסקציה קר (4 מעלות צלזיוס).
- הסר את המוח מהגולגולת על ידי חיתוך לאורך הסדק האורכי. מספר העוברים נע בדרך כלל בין חמישה לעשרה. כל מוח E14 מניב בערך 2 x 106 תאים, כולל אבות ונוירונים פוסט-מיטוטיים (יחס של 1:1)
הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ עבור השלבים הבאים.
- הסר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים דיסקציה. לפצל את telencephalon באמצע כדי להפריד את ההמיספרות. כדי לבודד את הטלנצפלון הדורסולטרלי, חתכו לאורך העקומה הגבית והגבול הפליאלי-תת-פליאלי באמצעות מלקחיים דיסקציה. מעבירים את הטלנספלון הדורסולטרלי לצינור של 2 מ"ל עם תווך דיסקציה קר (4 מעלות צלזיוס) עד שכל המוחות מנותחים.
2. דיסוציאציה וציפוי תאים
- הכן את מדיום ההתפשטות (50 מ"ל DMEM + 10% FCS): 44 מ"ל Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), 5 מ"ל סרום עגל עוברי (FCS), 0.5 מ"ל 40% גלוקוז, 0.5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מ"ל ו -10,000 מיקרוגרם / מ"ל). מסננים ומעקרים את מדיום ההתפשטות.
- הכנת מדיום בידול (50 מ"ל DMEM + 2% B27): 48 מ"ל DMEM, 1 מ"ל B27, 0.5 מ"ל 40% גלוקוז, 0.5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מ"ל ו -10,000 מיקרוגרם / מ"ל). סנן-עיקור מדיום הבידול.
- לאחר מיקרו-דיסקציה של הטלנספלון הדורסולטרלי מעכברי E14, צנטריפוגה את הצינור עם הרקמה שנאספה ומדיום דיסקציה קר (למשך 5 דקות ב 4 ° C, 340 x g) כדי לזרז את הרקמה.
- הסר את supernatant עם פיפטה ולהוסיף 1 מ"ל של מחומם מראש (37 ° C) טריפסין-Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (0.05%) לעיכול כימי. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. יש להוסיף 2 מ"ל של מדיום התפשטות כדי להפסיק את פעילות הטריפסין.
- לטש את קצה פיפטת פסטר זכוכית מעל מבער גז או מבער בונזן למשך מספר שניות כדי להצר מעט את הצמצם. שטפו את פיפטה על ידי שאיפת FCS כדי לצפות את הקצה. כדי למנוע בועות, נתקו את התאים באופן מכני עם פיפטת פסטר מלוטשת אש ומצופה FCS.
- צנטריפוגה את התאים (במשך 5 דקות ב 4 ° C, 340 x גרם). מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה. הוסף 1 מ"ל של מדיום התפשטות להשעות מחדש את התאים באמצעות פיפטה. חזור על שלב זה פעם אחת.
- הכינו דילול 1:1 של תרחיף התא באמצעות תמיסת Trypan Blue 0.4%. התאים שאינם בני קיימא יהיו כחולים. באמצעות תא נויבאואר, לספור את מספר התאים קיימא (לא מוכתמים).
- לדלל את התאים בתווך התפשטות כדי לקבל 106 תאים / מ"ל. הוסף 500 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת תרבית רקמה 24 באר (בערך 2.5 × 105 תאים / ס"מ2). לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2.
הערה: אין להשתמש בכיסויי זכוכית, מכיוון שהם יכולים לנוע במהלך הניסוי ולשנות את שדה התצפית. לחלופין, השתמש בלוחות תרבית רקמה תחתונה מזכוכית.
הערה: אם אינכם משתמשים במולטי-צלחות שטופלו בתרבית תאים, חשוב לטפל מראש בצלחות שלכם עם Poly-D-Lysin (50 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעתיים ב-37°C. ניתן לאחסן צלחות שטופלו ב-PDL ב-4°C לאחר שטיפה במים מזוקקים.