$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
הערה: יש להכין פתרונות תרביות תאים באמצעות הליכים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי ולסנן אותם ב-0.2 מיקרומטר כדי למנוע זיהום.
1. הכנת פתרונות ומדיום תרבות
- הכן תמיסת ציפוי למינין על ידי דילול 20 μL של 1 מ"ג / מ"ל מלאי למינין לתוך 2 מ"ל של H2O מזוקק סטרילי. יש להכין ביום הנתיחה.
- הכינו תמיסת עצירה של סרום 10% סוסים (סוסים) (ES) על ידי הוספת 5 מ"ל של ES ל-45 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת 1x Hank (HBSS). מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר או קצה מסנן מזרק. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) 4% על ידי הוספת 2 גרם אבקת BSA ל-1x מלח חוצץ פוספט (PBS) והבאתו לנפח סופי של 45 מ"ל. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר או קצה מסנן מזרק. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו תמיסת מלאי פפאין על ידי דילול פפאין ל-3 מ"ג/מ"ל ב-1x HBSS. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר או קצה מסנן מזרק. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
- הכן תמיסת דאוקסיריבונוקלאז (DNase) על ידי הוספת 20 מ"ג אבקת DNase ל- H2O סטרילי והבאתה לנפח סופי של 20 מ"ל. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר או קצה מסנן מזרק. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
- הכינו תמיסת ציר חומצה אסקורבית על ידי הוספת 352 מ"ג חומצה אסקורבית ל-H2O מזוקק סטרילי והבאתם לנפח סופי של 20 מ"ל. במידת הצורך, יש לחמם באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר או קצה מסנן מזרק. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
- הכן מדיום תרבית תאים על ידי הוספת הבאים 50 מ"ל של מדיום נוירובזאלי: 500 μL של גלוטמקס (100x), 500 μL סרום סוסים, 1 מ"ל של B-27, 100 μL של חומצה אסקורבית, 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, 50 μL של kanamycin ו 50 μL של ampicillin. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכן פתרון 0.01% Triton X-100 על ידי הוספת 1 מ"ל של Triton X-100 לתוך 9 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור פתרון של 10%. מכיוון שטריטון X-100 צמיג, פיפטה לאט כדי לאפשר לקצה להתמלא לחלוטין. מחממים באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס במידת הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- כדי לדלל 10% מניית Triton X-100 ל-0.01%, בצע 3 דילולים טוריים ביחס של 1:10. לדלל 1 מ"ל של 10% מלאי לתוך 9 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור פתרון 1%. לדלל 1 מ"ל של תמיסה 1% לתוך 9 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור 0.1% תמיסה. לדלל 1 מ"ל של תמיסה 0.1% לתוך 9 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור פתרון 0.01%.
- הכינו תמיסות סרום עיזים (NGS) רגילות של 10% ו-1% על ידי הוספת 1 מ"ל של NGS ל-9 מ"ל של 1x PBS לקבלת תמיסה של 10% ו-100 מיקרוליטר של NGS ל-9.9 מ"ל של 1x PBS ליצירת תמיסה של 1%.
- הכינו תמיסת ציר גלוטמט (100 מילימול) על ידי הוספת 735 מ"ג חומצה L(+)-גלוטמית ל-H2O מזוקק סטרילי והבאתם לנפח סופי של 50 מ"ל. מסיסות בריכוז זה תהיה בעיה. הוספת נפחים קטנים (100 μL) של חומצה הידרוכלורית 1M מספיקה כדי להגדיל את מסיסות.
- הכן תמיסת מלאי NBQX (10 mM) על ידי הוספת 50 מ"ג NBQX ל- H2O מזוקק סטרילי והבאתה לנפח סופי של 13 מ"ל.
2. הכנת כלי תרבות וכיסויים (נעשה יום לפני נתיחה)
הערה: מצאנו כי שילוב של שלושה חומרי ציפוי, פולי-L-ליזין, פולי-L-אורניתין ולמינין, מאפשר הידבקות תאים אידיאלית וכדאיות.
- מניחים 10 צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ בארון בטיחות ביולוגי. מניחים שתי כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ בכל צלחת וממלאים ב-70% EtOH למשך 10 דקות. השתמשו בקו ואקום כדי לשאוב את ה-EtOH שנותר מכל מנה, ואפשרו ל-EtOH להתאדות לחלוטין.
- פיפטה ~ 90-100 μL של תמיסת פולי-L-ליזין 0.1% על כל כיסוי, תוך הקפדה על כיסוי כיסוי. מכסים את הכלים במכסים ומניחים אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- יש לשאוף את תמיסת הפולי-L-ליזין הנותרת מכל כיסוי ולשטוף עם H2O סטרילי.
- חזור על שלבים 2.2 – 2.3 עם תמיסת פולי-L-אורניתין 0.1%.
- שוב, חזור על שלבים 2.2 – 2.3 עם תמיסת למינין 0.01%. מניחים באינקובטור CO2 של 37°C/5% עד שהוא מוכן לציפוי התא למחרת.
3. נתיחות עובריות של עכבר
הערה: אנו משתמשים בין 4 ל-6 עכברות הרות מתוזמנות בכל תרבית. בעוד שרוב תהליך הדיסקציה מתרחש מחוץ לארון בטיחות ביולוגי, עדיין חשוב לשמור על הליך סטרילי. שימוש נרחב של 70% EtOH על משטחים ליד מיקרוסקופ דיסקציה ועל כלי ניתוח הוא אידיאלי. ניתן גם ללבוש מסכה במהלך הנתיחה כדי למנוע עוד יותר זיהום. בנוסף, אנו משתמשים ב-4 סוגי אנטיביוטיקה נפרדים במדיום התרבית, כך שהסבירות לזיהום אינה סבירה. עם זאת, אם השימוש באנטיביוטיקה הוא בעייתי, מערך דיסקציה זה יכול להיות מועבר בתוך מכסה מנוע סטרילי. כדי לשמור על כדאיות התא, כל פתרונות הדיסקציה צריכים להיות מקוררים מראש ב -4 מעלות צלזיוס, ויש להשלים את הניתוחים במהירות האפשרית. אנחנו לא מבצעים את הנתיחות על קרח. השיטה לדיסקציה של נוירונים עובריים במוח התיכון של עכבר זהה לשיטות שתוארו קודם לכן.
- הכינו מקום על ספסל ליד מיקרוסקופ דיסקציה עם פד סופג ורססו בנדיבות עם 70% EtOH.
- רססו שתי צלחות פטרי מזכוכית בגודל 100X15 מ"מ וצלחת פטרי אחת מזכוכית בגודל 50X10 מ"מ עם 70% EtOH ואפשרו ל-EtOH להתאדות. לאחר האידוי, הכניסו 50 מ"ל של HBSS סטרילי 1x לתוך כל צלחת פטרי בגודל 100X15 מ"מ.
- יש לטבול מספריים כירורגיים, מלקחיים ולהב מיקרוטום ב-70% EtOH למשך 10 דקות לפחות לעיקור. הניחו את המכשירים על כרית הסופגה לייבוש.
- באמצעות CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם, להרדים עכברות הריון מתוזמן בן 2-3 חודשים ביום העוברי 14.
- רססו את בטנם של העכברים המורדמים ב-70% EtOH. בעזרת מלקחיים תופסים את הבטן התחתונה ופותחים את חלל הבטן באמצעות מספריים כירורגיים. התחילו לחתוך קרוב למקום שבו המלקחיים מחזיקים את הבטן, ובצעו חתכים רוחביים בכל צד עד שניתן יהיה לקפל את דופן הבטן לאחור והרחם נראה בבירור.
- באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את שני הקצוות של קרן הרחם. לאחר מכן, להסיר את הרחם ולהניח אותו לתוך צלחת פטרי עם 1x HBSS.
- בעזרת מלקחיים בעלי קצה ישר מוציאים בזהירות עוברים מהרחם. השאירו עוברים בHBSS לאורך כל התהליך הזה. באמצעות המלקחיים או להב מיקרוטום, ערפו במהירות עוברים על ידי חיתוך ליד הצוואר. ביצוע חיתוך ברמה גבוהה ככל האפשר.
- תחת מיקרוסקופ מנתח, מעבירים ראש עובר לצלחת פטרי יבשה בקוטר 50 מ"מ ומניחים אותו בצד הגחוני. ייצבו את הראש בעזרת מלקחיים על ידי הצבה וחדירה ליד העיניים/חוטם. המלקחיים צריכים להיות בזווית כלפי מטה ב~ 45° כדי למנוע חדירה למזנצפלון.
- בעזרת המלקחיים, לעומת זאת, הסירו בזהירות את שכבת העור והגולגולת השקופה ממש לפני הרכס הבולט של המזנצפלון. התחל ליד קו האמצע והסר את העור והגולגולת באופן קאודלי עד שהמזנצפלון נחשף במלואו.
- החזיקו את המלקחיים בניצב למזנצפלון החשוף, עם קצה אחד בין קליפת המוח למזנצפלון והשני ליד המוח הקטן. לחץ למטה וצבוט את המלקחיים יחד כדי להסיר את כל המוח האמצעי. עובי מקטע המוח התיכון צריך להיות כ-0.5 מ"מ. הכניסו את החלק של המוח התיכון לצלחת הפטרי השנייה המלאה ב-1x HBSS טרי. חזור על תהליך זה עבור כל עובר.
- באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את מקטע המוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. אם קרומי המוח עדיין מחוברים, הסר אותם בזהירות על ידי תפיסתם עם המלקחיים והרם למעלה והרחק מאזור המוח.
- למקטע המוח צריכים להיות 4 רבעים גלויים. מקם את הקטע כך ששני הרבעים הקטנים יותר ימוקמו עדיפים על שני הרבעים הגדולים יותר. ישנו רכס בולט המפריד בין שני הרבעים העליונים (הקטנים) לבין שני הרבעים הנחותים (הגדולים).
- בעזרת המלקחיים, צבטו והפרידו את הרבעים העליונים מהרבעים הנחותים, ולאחר מכן השליכו את הרבעים העליונים. לרבעים הנחותים הנותרים תהיה רקמה עודפת לרוחב בצד הגבי, רקמה זו תיראה פחות אטומה מרקמת הגחון הנותרת. הסר את הרקמה הגבית הצפופה פחות והשליך. המקטע הנותר צריך להכיל הן את Substantia nigra pars compacta (SNc) והן את אזור הטגמנטל הגחוני (VTA).
- באמצעות המלקחיים חותכים את מקטע רקמת הגחון הנותר ל -4 חתיכות קטנות יותר ובאמצעות פיפטה ברוחב 1 מ"ל מעבירים מקטעים אלה בצינור חרוטי 15 מ"ל עם HBSS 1x. שמור את הצינור החרוטי עם קטעי מוח על קרח לאורך כל ההליך.
- חזור על תהליך זה עבור כל מקטעי המוח הנותרים.
4. דיסוציאציה של תאים
- עיכול אנזימטי של תאים
- שאפו בזהירות את HBSS מהצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל מקטעים במוח האמצעי, והותירו את המקטעים בתחתית הצינור.
- הוסף ~ 800 μL של תמיסת פפאין לצינור והכנס לאינקובטור של 37 ° C למשך 7 דקות. השהה תאים מחדש על ידי הבהוב הצינור והחלף באינקובטור 37 ° C למשך 7 דקות נוספות.
- עם קצה פיפטה רחב 1 מ"ל להסיר רק את קטעי המוח התיכון לתוך aliquot 1 מ"ל של DNase. אפשר למקטעים להגיע לתחתית האליקוט או כדקה של חשיפה.
- עם קצה פיפטה רחב 1 מ"ל להסיר רק את קטעי המוח התיכון לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת עצירה. אפשרו למקטעים לשקוע בתחתית הצינורית וחזרו על השטיפה בצינור חרוטי נוסף מלא בתמיסת עצירה.
- טריטורציה מכנית של השעיית התא
- בתחנה השנייה, פתרון לשטוף צינור, באמצעות קצה פיפטה רחב 1 מ"ל, פיפטה את התאים למעלה ולמטה 10 פעמים עד שאין קטעי רקמה גדולים גלויים. חשוב להימנע מהטיטורציה יתר עבור ליזה מינימלית של תאים.
- פיפטה איטית 300 μL של 4% BSA פתרון לתחתית צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל קטעי מוח. בזהירות להסיר את קצה פיפטה כדי לשמור על שכבת תלייה. צנטריפוגה ב 0.4 x גרם במשך 3 דקות. לאחר מכן, בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend תאים ב 400 μL של מדיום תרבית התא.
5. ציפוי התאים
הערה: בהתבסס על ניסיון, נאספים כ-100,000 תאים ברי קיימא לכל עובר. לעכברות הרות מתוזמנות בנות 2-3 חודשים יש בדרך כלל גודל המלטה של 8-10 עוברים; לכן, הערכה גסה עבור התפוקה הכוללת של תאים לכל עכבר בהריון מתוזמן הוא כמיליון תאים.
- באמצעות המוציטומטר, בצע ספירת תאים ולאחר מכן לדלל את התרחיף ל -2,000 תאים / μL באמצעות מדיום תרבית תאים. מזלפים לערבוב קצר.
- הסר כיסויים עם תמיסת למינין משלב 2 מהאינקובטור ושאפו את תמיסת הלמינין הנותרת מהכיסויים המצופים באמצעות ואקום. יש להקציף במהירות כדי למנוע התייבשות מוחלטת של הכיסויים. פיפטה 100 μL (2.0 x 10,5 תאים/כיסוי) על כל כיסוי, ומניחים את צלחות הפטרי באינקובטור של 37°C למשך שעה אחת.
- הוסיפו בזהירות 3 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל מנה והחזירו אותה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. בצע שינויים חצי בינוניים פעמיים בשבוע במשך שבועיים.
6. זיהום של תרבית תאים ב 14 DIV עם וקטורים נגיפיים הקשורים אדנו (AAV)
- עבור כל מנה, להכין 1 מ"ל של מדיום DMEM ללא סרום עם 1 μL של hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x10 13 titer)
- שאפו את מדיום תרבית התאים מכל צלחת והחליפו אותו ב-1 מ"ל DMEM ללא סרום המכיל hSyn-GCaMP6f. לאחר מכן, החזירו את הכלים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- שאפו את המדיום נטול הסרום המכיל AAVs והחליפו אותו ב-3 מ"ל של מדיום תרבית תאים. מחזירים את הכלים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות. מצאנו כי 5-7 ימים של זיהום AAV מאפשר רמות אידיאליות של ביטוי GCaMP. במהלך תקופה זו של זיהום ויראלי, להמשיך לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.
7. הדמיה קונפוקלית חיה Ca2+ בין 19-21 DIV
- הכנת מאגרי הקלטה
- כדי ליצור 1 L של מאגר הקלטה HEPES, הוסף: 9.009 גרם של NaCl, 0.3728 גרם של KCl, 0.901 גרם של D-גלוקוז, 2.381 גרם של HEPES, 2 מ"ל של 1 M CaCl2 תמיסת מניות, ו 500 μL של 1 M MgCl2 תמיסת מלאי ל 800 מ"ל של H2O. מזוקק סטרילי להביא את ה- pH ל 7.4 עם NaOH. מביאים לנפח סופי של 1 ליטר.
- כדי ליצור 200 מ"ל של 20 מיקרומטר מאגר רישום גלוטמט, דלל 40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי גלוטמט של 100 מ"ל לתוך 200 מ"ל של מאגר הקלטה HEPES שתואר לעיל.
- כדי ליצור 200 מ"ל של 10 מיקרומטר מאגר הקלטה NBQX, דלל 200 מיקרוליטר של 10 mM NBQX תמיסת מלאי לתוך 200 מ"ל של מאגר הקלטה HEPES.
- הדמיה קונפוקלית
- ממלאים צלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מ"מ ב-3 מ"ל של חיץ הקלטה.
- הסר צלחת פטרי 35 מ"מ עם תרביות נגועות מאינקובטור 37 מעלות צלזיוס. בעזרת מלקחיים עדינים, תפסו בזהירות את קצה הכיסוי האחד והעבירו אותו במהירות לצלחת הפטרי המלאה במאגר הקלטה. הניחו את הכיסוי הנותר בתווך בחזרה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את המנה עם מאגר ההקלטה למיקרוסקופ הקונפוקלי.
- הפעל את תוכנת ההדמיה. המשך לשלב הבא בעת אתחולו.
- הפעל את המשאבה הפריסטלטית והנח את הקו במאגר ההקלטה. כייל את מהירות הזרימה כך שתהיה 2 מ"ל/דקה.
- העבירו את הכיסוי הנגוע מצלחת פטרי 35 מ"מ לתוך אמבט ההקלטה.
- באמצעות המטרה טבילה במים פי 10 ואור BF, מצא את מישור המיקוד וחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופי תאי עצב. עבור למטרה טבילה במים 40x והשתמש באור BF, מקד מחדש את הדגימה.
- בחלון "רשימת צבעים" בתוך FluoView, בחר AlexaFluor 488 והחל אותו.
- ביטוי AAV יכול להיות משתנה; לכן, על מנת למנוע חשיפת יתר והלבנה של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות HV ולייזר נמוכות. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את המתח הגבוה (HV) ל- 500, את הרווח ל- 1x ואת הקיזוז ל- 0. עבור קו לייזר 488, הגדר את הכוח ל -5%. על מנת להגדיל את הנפח האפקטיבי המצולם במישור z, הגדל את גודל חור הסיכה ל -300 מיקרומטר. השתמש באפשרות הסריקה "פוקוס x2" כדי להתאים באופן אופטימלי את אותות הפליטה לרמות תת-רוויה. מכאן, ניתן לכוונן את ההגדרות עד להשגת הנראות האידיאלית של כל ערוץ.
הערה: כדי ללכוד במדויק את הטווח המלא של שטפי Ca2+ עם GCaMP, התאם את הגדרות HV ועוצמת הלייזר הבסיסיות כדי לאפשר עלייה בעוצמת הפלואורסצנט מבלי להרוות יתר על המידה את הגלאי.
- לאחר אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ, הזיזו את הבמה על מנת לאתר אזור עם תאים מרובים המציגים שינויים ספונטניים בפלואורסצנטיות GCaMP6f והתמקדו במישור הרצוי להדמיה.
- השתמש בכלי "Clip rect" כדי לחתוך את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח מסגרת של קצת פחות משנייה אחת. זה הכרחי כדי להגדיר את מרווח הדמיה על 1 מסגרת לשנייה.
- הגדר את החלון "מרווח" לערך של 1.0 ואת החלון "מספר" ל- 600.
הערה: על מנת לספק מאגרי הקלטה שונים בנקודת הזמן הרצויה (300 שניות), חשוב לכייל את זמן ההשהיה של המשאבה כדי לספק את הפתרון החדש לאמבטיה. זה יהיה תלוי בקצב זילוח התמיסה (2 מ"ל לדקה) ובאורך הקו המשמש לשאיבת התמיסה.
- כדי לצלם סרט מסדרת t, בחר באפשרות "זמן" ולאחר מכן השתמש באפשרות הסריקה "XYt" כדי להתחיל בהדמיה.
- צפה במד התקדמות ההדמיה והזז את הקו ממאגר ההקלטה HEPES למאגר רישום הגלוטמט של 20 מיקרומטר בנקודת הזמן המתאימה (לדוגמה, אם השהיית המשאבה מכויילת לספק תמיסה ב- 60 שניות, העבר את הקו למאגר הגלוטמט ב- 240 פריימים כדי לספק גלוטמט ב- 300 שניות).
- לאחר השלמת ההדמייה, בחר בלחצן Series Done ושמור את הסרט המוגמר מסדרת t. המשך לנקב 20 מיקרומטר גלוטמט במשך 5 דקות נוספות, כך שתאי העצב בתרבית נחשפו לגלוטמט במשך 10 דקות בסך הכל. חזור על תהליך זה עבור כל תלוש כיסוי לתמונה.
- לאחר 5 דקות נוספות של חשיפה לגלוטמט של 20 מיקרומטר, הסירו את הכיסוי מהאמבטיה והחזירו אותו לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה חיץ הקלטה עד להשלמת יום ההדמיה.