הכנת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של קליפת המוח של עכברוש

תקציר

מקור: Valente, C. A., et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים שיטה להשגת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של קליפת המוח ממוחו של גור חולדות וטיפוחן בתוספות קרומיות בתוך צלחת מרובת בארות מלאה במדיה לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס

הערה: הכנת פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס משתמשת בחולדות P6-7 Sprague-Dawley.

1. מערך תרבות והכנה בינונית
   1. ביום שלפני התרבות, להכין את המדיה הנדרשת ולמקם אותם ב 4 ° C.
   2. הכינו אמצעי דיסקציה: 25 מ"מ גלוקוז בתמיסת מלח מאוזנת של גיי (GBSS).
   3. הכנת תרבית בינונית: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% סרום סוסים (HS), 25 mM גלוקוז, 30 מיקרוגרם / מ"ל Gentamycin.
   4. הכן אמצעי תחזוקה: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-גלוטמין, 30 מיקרוגרם / מ"ל Gentamycin, HS (15%, 10%, 5% ו 0%).
2. קצירת מוחות
   1. ממש לפני תחילת התרבית, להוסיף 1.1 מ"ל של מדיום תרבית לכל באר של צלחת 6 באר עם פיפטה P1000 ומניחים אותו ב 37 ° C.
   2. הניחו את כל הציוד (מיקרוסקופ דיסקציה, מסוק רקמות, מנורת נתיחה, כלי ניתוח, אלקטרודות, לוחות, תוספות וניירות סינון) בתוך ארון הבטיחות הביולוגי וחיקרו תחת אור UV למשך 15 דקות.
   3. התאימו את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר.
   4. משכו את ה-GBSS מהמקרר. הוסיפו 5 מ"ל GBSS לשש צלחות פטרי. שש צלחות פטרי יידרשו לכל חיה.
   5. הרדימו את גור העכברושים. בצע עריפת ראש באמצעות מספריים חדים בבסיס גזע המוח של החיה.
   6. שטפו את ראש בעל החיים שלוש פעמים ב-GBSS קר והכניסו אותו לארון הבטיחות.
3. בידוד רקמות והכנת פרוסות
   1. הכנס בחוזקה מלקחיים חדים לארובות העיניים כדי להחזיק את הראש.
   2. בעזרת מספריים דקים חותכים את העור/הקרקפת לאורך קו האמצע החל מפתח החוליות לכיוון האונות הקדמיות ומניחים אותו בצד.
   3. חותכים באותו אופן כמו הגולגולת ולאורך הסדק הרוחבי המוחי (רווח בין המוח למוח הקטן). בעזרת מלקחיים ארוכים ומעוקלים, הזיזו אותו זה מזה.
   4. השליכו את נורות הריח בעזרת מרית. הסירו את המוח מהראש ומקמו אותו ב-GBSS קר כקרח כשהמשטח הגבי פונה כלפי מעלה (איור 1A).
   5. הכניסו את המלקחיים העדינים לתוך המוח הקטן ולכו לאורך קו האמצע, כאשר המרית פותחת כל חצי כדור בזהירות רבה (איור 1B).
   6. בעזרת מלקחיים קצרים, הסירו בזהירות את הרקמה העודפת המכסה את ההיפוקמפי, מבלי לגעת במבנה ההיפוקמפוס. לאחר מכן בעזרת מרית, חתכו מתחת לכל היפוקמפוס (איור 1C).
   7. הרימו חצי כדור אחד והניחו אותו, כשההיפוקמפוס פונה כלפי מעלה, על נייר סינון. חזור על התהליך עם חצי הכדור השני ומקם אותו במקביל לראשון, בנייר הסינון. הניחו את נייר הסינון על מסוק הרקמות, כאשר ההמיספרות ניצבות ללהב, וחתכו את ההמיספרות לפרוסות של 350 מיקרומטר (איור 1D).
   8. הניחו את הרקמה החתוכה בתוך צלחת פטרי עם GBSS קר (איור 1E).
   9. הפרידו בזהירות את הפרוסות באמצעות אלקטרודות הקצה העגולות (איור 1F). שמור רק את הפרוסות עם קליפת המוח הרינלית וההיפוקמפוס שלמים מבחינה מבנית. אזורי DG ו-CA צריכים להיות מוגדרים באופן מושלם, כמו גם קליפת המוח האנטורינלית והפרירינלית (איור 1G).
   10. הניחו כל פרוסה על האינסרט (איור 1H-I), בעזרת מרית ואלקטרודה בעלת קצה עגול. הסירו את אמצעי הדיסקציה העודפים סביב כל פרוסה בעזרת פיפטה P20 (איור 1J). ניתן לגדל בתרבית ארבע פרוסות קליפת המוח הרינלית וההיפוקמפוס בתרבית אחת (איור 1K).
4. תחזוקת תרבות
   1. החליפו את המדיום אחת ליומיים.
   2. לחמם את המדיום ב 37 °C (77 °F).
   3. קח את הצלחות מהאינקובטור. הרימו כל תוספת על-ידי החזקת קצה הפלסטיק במלקחיים (איור 1L).
   4. השתמש ביד חופשית כדי לשאוף את המדיום מן הבאר. החזירו את האינסרט לבאר והוסיפו 1 מ"ל, עם פיפטה P1000, של תווך טרי ומחומם (איור 1M). חזור על הפעולה עבור כל התוספות. יש לוודא שלא נלכדות בועות אוויר בין הממברנה לתווך.

תוצאות

איור 1: הליך מפורט להכנת פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הרינלית-היפוקמפוס. (A) הסר את המוח מהראש ומקם אותו ב-GBSS קר כקרח כשהמשטח הגבי פונה כלפי מעלה. (B) הכניסו את המלקחיים לתוך המוח הקטן. פתחו את המוח דרך קו האמצע והוציאו את הרקמה העודפת מעל ההיפוקמפוס. (C) עם מרית חתוכה מתחת להיפוקמפוס, כפי שמצוין על-ידי החיצים. (D) הניחו את שנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
להבים לידית אזמל	כלים מדעיים משובחים	10011-00
מערכת תא פרוסת מוח/רקמה	וורנר אינסטרומנטס
תוספות תרבית תאים, 30 מ"מ, PTFE הידרופילי	Millipore SAS	PICM03050
חממה קונבנציונלית	Thermo Scientific Heraeus	BB15, שורת פונקציות	מוגדר ל-37°C ו-5% CO2
D(+)-גלוקוז מונוהידראט	מרק מיליפור	1.08342.1000
D-(+)-תמיסת גלוקוז, 45% במים	סיגמא	G8769
די-נתרן מימן פוספט דיהידראט	מרק מיליפור	1.06580.1000
Dumont #5 מלקחיים עדינים Biologie Inox	כלים מדעיים משובחים	11254-20
Dumont #5 מלקחיים סטנדרטי Inox	כלים מדעיים משובחים	11251-20
Dumont #7 מלקחיים סטנדרטי Dumoxel	כלים מדעיים משובחים	11271-30
Dumont Medical #7S מלקחיים עקומה קצרה Inox	כלים מדעיים משובחים	11273-22
תמיסת מלאי Gentamycin, 50 מ"ג/מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	15750-037
תמיסת מלח מאוזנת של Gey (GBSS)	תעשיות ביולוגיות	01-919-1א
אלקטרודות זכוכית	מוצרים מדעיים	GB150F-10	טיפים עגולים תוצרת בית
פיפטות פסטר זכוכית, 230 מ"מ	VWR הבינלאומי	612-1702
סרום סוסים, מנוטרל בחום (HS)	תרמו פישר סיינטיפיק	26050-088
איריס מרית מעוקלת	כלים מדעיים משובחים	10092-12
Labculture Class II ארון בטיחות ביולוגי	הראספה	HS 12
תמיסת L-גלוטמין 200 מ"מ (Q)	תרמו פישר סיינטיפיק	25030-024
Neurobasal-A בינוני (NBA)	תרמו פישר סיינטיפיק	10888-022
Opti-MEM® I סרום מופחת בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	31985-047
פלטינום 5 להבים	ג'ילט
נייר סינון איכותי, תאית, דרגה 1, 55 מ"מ	מה איש	1001-055	שימור בינוני 11 מיקרומטר
נייר סינון איכותי, תאית, דרגה 1, 90 מ"מ	מה איש	1001-090	שימור בינוני 11 מיקרומטר
ידית אזמל	כלים מדעיים משובחים	91003-12
צלחות סטריליות 6 בארות מטופלות TC	קורנינג	CORN3516
בקר Temperatue	חברת מערכות רפואיות	TC-102
קוצץ רקמות	מיקל מעבדה הנדסה ושות 'בע"מ	MTC/2	הגדר ל- 350 מיקרומטר