בידוד נוירונים חושיים וטיפוח משותף עם תאי הרג טבעיים

תקציר

מקור:Ahmadi, A., et al. מתגרה ביחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לנוירונים nociceptor. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מתאר את הבידוד של נוירוני DRG באמצעות עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית. תאי DRG מתורבתים יחד עם תאי הרג טבעיים על מטריצה חוץ-תאית כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי מערכת החיסון לבין נוירונים חושיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי

1. צור נוירון nociceptor שלם (בקרת littermate; TRPV1wt::D TAfl/wt) ועכברי ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) על ידי חציית עכברי רעלן lox-stop-lox-diphtheria (DTAfl/fl) עם עכברי TRPV1cre/wt.
2. באמצעות שאיפת CO2, הרדימו עכבר נאיבי (TRPV1wt::D TAfl/wt).
3. יש לאסוף את הטחול בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 מיקרוליטר של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS).
4. הומוגניזציה של הטחול באמצעות מזיק.
5. לדלל את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
6. מסננים את התערובת דרך מסננת תאים של 50 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
7. ממלאים את עוצמת הקול (10 מ"ל) עם PBS סטרילי.
8. לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
9. צנטריפוגו את התאים (500 × גרם, 5 דקות) והסירו את הסופרנטנט.
10. להשהות מחדש את התאים בריכוז של 10⁸ תאים/מ"ל בתווך סל"ד 1640 בתוספת סל"ד.
11. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לטהר באופן מגנטי תאי הרג טבעי של הטחול (NK) באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר. אשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריית זרימה.
12. לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
13. צנטריפוגו את התאים (500 × גרם, 5 דקות) והסירו את הסופרנטנט.
14. השהה מחדש את תאי ה- NK בתווך תרבית RPMI 1640 בתוספת (המכיל IL-2 ו- IL-15).
15. תרבית 2 × 10⁶ תאי NK / מ"ל בצלחת U-תחתונה 96 באר למשך 48 שעות.

2. בידוד תאי עצב DRG ותרבית

1. ב-24 שעות לפני סיום גירוי תאי ה-NK (שלב 1.15), יש לצפות צלחת בת 96 בארות ב-100 מיקרוליטר/באר של למינין (1 ננוגרם/מ"ל) ולדגור במשך 45 דקות (37°C).
2. לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית.
3. באמצעות שאיפת CO2, המתת חסד נוירון nociceptor שלם (בקרת littermate; TRPV1wt::D TAfl/wt) או ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) עכברים.
   הערה: שאיפת CO2 עדיפה על פריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא נמנעת משיבוש עצבי עמוד השדרה המחוברים ל- DRG (גנגליון שורש גבי).
4. אבטחו את העכבר על הלוח במצב נוטה, הרימו את העור וחתכו את העור לאורך עמוד הגב.
5. חותכים את המפרק המותני ומפרידים את עצם העצה מעמוד השדרה המותני בעזרת מספריים.
6. הפרידו את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני צידי עמוד השדרה בכיוון הגולגולת עד להגעה לבסיס הגולגולת.
7. באמצעות מספריים, לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlanto-occipital.
8. הסר שריר ורקמת שומן מעמוד השדרה.
9. הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה ולקבל גישה ל- DRG. חפש את DRG בפורמינה הבין חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי אך מופרדת מקרומי המוח.
10. קצרו את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של תוסף DMEM קר כקרח.
11. צנטריפוגות את ההכנה (200 × גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant.
12. הוסף 250 μL של PBS המכיל Collagenase IV (1 מ"ג / מ"ל) ו Dispase II (2.4 U / mL).
13. יש לדגור על DRG עם תמיסת Collagenase IV/Dispase II (C/D) (80 דקות, 37°C, תסיסה קלה). בעת איגום גרעינים ממספר עכברים, לשמור על יחס של 125 μL של תמיסת C/D לכל גנגליון .
14. כדי להשבית את האנזימים, להוסיף 5 מ"ל של תוספת DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) בינוני.
15. צנטריפוגו את התמיסה (200 × גרם, 5 דקות) והסירו בעדינות את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
16. כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי, השאר ~ 100 μL של supernatant.
17. הוסף 1 מ"ל של מדיום DMEM מוסף.
18. בעזרת אקדח פיפטה ושלוש פיפטות פסטר מזכוכית בגדלים הולכים ופוחתים, טריטוראט בעדינות (~ 10 למעלה/למטה לכל גודל פיפטת פסטר) את ה- DRG להכנה חד-תאית.
19. בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS סטרילי (מלח חוצץ פוספט) לריכוז סופי של 15%. יש לאחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.
20. צור שיפוע BSA בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS סטרילי והפצה איטית של 1 מ"ל של תמיסת BSA 15% בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של פיפטה.
21. באמצעות פיפטה P200, מחזירים באיטיות את תרחיף הגרעינים המשולש (המכיל את הנוירונים) לצד הצינור לתוך השיפוע.
22. צנטריפוגה את שיפוע BSA המכיל נוירונים (200 × גרם, 12 דקות, טמפרטורת החדר). הגדר את התאוצה וההאטה של הצנטריפוגה למהירות המינימלית.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, תאי העצב יהיו בתחתית הצינור, בעוד שפסולת התא תילכד בשיפוע BSA.
23. מוציאים בעדינות את כל הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
24. Resuspend את התאים ב 500 μL של Neurobasal.
25. צלחת 10⁴ נוירונים לכל באר (200 מיקרוליטר של נוירובזל/באר) בצלחת מצופה למינין, בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
    הערה: בממוצע, חוקר יוכל למלא ~ 8 בארות לכל עכבר.
26. תרבית את תאי העצב (37 מעלות צלזיוס, לילה) כדי לאפשר התקשרות.

3. תרבות משותפת

1. לאט לאט להסיר את neurobasal מן התרבות נוירון.
2. לאחר גירוי של 48 שעות עם IL-2 ו- IL-15 (ראה שלבים 1.14-1.15), השהה מחדש את תאי ה- NK והוסף 10 תאי⁵ NK / באר לתרבית הנוירונים (צלחת תחתונה שטוחה 96 באר).
   הערה: בממוצע, החוקר יוכל למלא ~ 6 בארות לכל עכבר.
3. תרבית משותפת של התאים בתוסף נוירו-בסיסי MX (37°C, 48 שעות).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
B-27	מעבדת ג'קסון	מס' קטלוגי: 009669
דרגת תרבית אלבומין בסרום בקר (BSA)	מכשירים מדויקים בעולם	מס' קטלוגי: 504167
BV421 נגד עכבר NK-1.1	פישר סיינטיפיק	מס' קטלוגי: 12430112
מסננת תאים (50 מיקרומטר)	פישר סיינטיפיק	מס' קטלוגי: A3160702
קולגנאז IV	פישר סיינטיפיק	מס' קטלוגי: 15140148
דיספאס השני	פישר סיינטיפיק	מס' קטלוגי: 13-678-20B
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM)	פישר סיינטיפיק	מס' קטלוגי: 07-200-95
ערכת בידוד תאי NK עכבר EasySep	סיגמא	מס' קטלוגי: CLS2595
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	סיגמא	מס' קטלוגי: C0130
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא	מס' קטלוגי: 806552
פיפטה פסטר זכוכית	סיגמא	מס' קטלוגי: 470236-274
גורם נוירוטרופי הנגזר מקו תאי גליה (GDNF)	VWR	מס' קטלוגי: 02-0131
למינין	ארזלן	מס' קטלוגי: 03-50/31
ל-גלוטמין	גיבקו	מס' קטלוגי: A14867-01
עכבר רקומביננטי IL-15	גיבקו	מס' קטלוגי: 22400-089
עכבר רקומביננטי IL-2	גיבקו	מס' קטלוגי: 21103-049
גורם גדילה עצבי (NGF)	לייף טכנולוגיות	מס' קטלוגי: 13257-019
מדיה נוירובזאלית	פפרוטק	מס' קטלוגי: 450-51-10
פניצילין וסטרפטומיצין	פפרוטק	מס' קטלוגי: 210-15
פסטלס	טכנולוגיית תאי גזע	מס' קטלוגי: 19855
מלח חוצץ פוספט (PBS)	ביואגדה	מס' קטלוגי: 108732	שיבוט PK136
מדיה RPMI 1640	ביואגדה	מס' קטלוגי: 137606	שיבוט 29A1.4
פינצטה וכלי נתיחה.	ביואגדה	מס' קטלוגי: 65-0865-14
צלחת 96 בארות תחתונה בצורת U	ביואגדה	מס' קטלוגי: 101319
כדאיות צבע eFlour-780	בקטון דיקינסון
אינקובטור CO2
מיקרוסקופ דיסקציה