בידוד ותרבית של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים במוח התיכון

תקציר

מקור: Er, S., et al. חקר הצטברות α-סינוקלאין המושרה על ידי פיבריל בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים במוח התיכון של עכבר. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של נוירוני דופמין מהמוח התיכון של עוברי עכברים. רצפות המוח התיכון הגחוני המבודד מנותקות באמצעות אנזימים. נוירוני הדופמין המתקבלים נקצרים ומועברים למיקרו-איים בתוך צלחות מרובות בארות. התאים מודגרים בתווך נוירון דופמין כדי לשמור על התאים בצפיפות גבוהה בתוך המיקרו-איים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנה

1. הכינו דופמין נוירון בינוני (DPM) עם 0.46% D-גלוקוז, 1% L-גלוטמין, 1% N2, 0.2% פרימוצין, עם תערובת מדיום/חומר מזין של Dulbecco F-12 (DMEM/F12). סנן את ה- DPM לאחר ערבוב החומרים. יש לאחסן DPM בטמפרטורה של 4°C ולחמם כל aliquot פעם אחת בלבד.
   הערה: DPM לא אמור להכיל גורם גדילה הנגזר מקו תאי גליה (GDNF), מכיוון שהוא יפחית הצטברות α-סינוקלאין בנוירוני דופמין.
2. להכין פיפטות זכוכית סיליקון כי הם הידרופוביים מאוד, ובכך למזער את ההתקשרות על פני השטח ואובדן של תאים במהלך הטיפול הראשוני של נוירונים עובריים.
   1. מוסיפים 10 מ"ל של נוזל סיליקון ל-1 ליטר מים מזוקקים ומערבבים על ידי ערבוב בכלי של 2 ליטר. השאירו את פיפטות הזכוכית שקועות בתמיסת הסיליקון למשך 15 דקות.
   2. שטפו את הפיפטות 3-5 פעמים במים מזוקקים. יבשו את הפיפטות למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT) או למשך 1-2 שעות ב-100-120 מעלות צלזיוס חלל סטרילי מחומם כדי לזרז את הייבוש.
   3. לעקר את פיפטות על ידי autoclaving סטנדרטי בשקית autoclave אטום.
3. הכינו לוחות באר מצופים פולי-L-אורניתין (PO) עם תחתיות שקופות על ידי הוספת 60 μL של תמיסת PO לבארות האמצעיות של צלחת הקידוח 96 שישמשו לזריעה של הנוירונים, תוך השארת לפחות שורה/עמוד אחד של בארות בשולי הצלחת כדי למנוע השפעות קצה. שמור את הצלחת המצופה למשך הלילה ב 4 ° C או 4 שעות ב RT.
4. לפני ציפוי התאים, יש לשאוף PO לחלוטין ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x פוספט-חוצץ מלוחים (PBS). שאפו 1x PBS מהבארות והשאירו את מכסה הצלחת פתוח לייבוש מלא.
   הערה: ניתן לאסוף PO משומש ולסנן אותו לשימוש חוזר. ניתן לחזור על פעולה זו פעמיים עבור אותו פתרון PO.
5. הוסף 50 μL של DPM לבארות מצופות בעבר. שואפים DPM מהבארות עם קצה פלסטיק של 100 μL ובו זמנית מגרדים את תחתית הבאר בתנועות מעגליות כדי להסיר את הציפוי בהיקף של כל באר. אי מצופה PO יישאר באמצע הבאר.
6. מתחת למכסה מנוע למינרי, הוסף 10 μL של DPM למרכז כל אי מצופה כדי ליצור micro islands.
   הערה: צלחת עם איי מיקרו מכוסים DPM יכולה להישמר מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית למשך 1-2 שעות במהלך בידוד התאים

2. בידוד רצפת המוח האמצעית הגחונית מהיום העוברי 13.5 (E13.5) עוברי עכבר

1. לפני הנתיחה, מלאו צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ בחיץ של דולבקו ושמרו אותה על קרח.
2. יש להרדים עכברה הרה E13.5 בהתאם להנחיות המוסד. הניחו את העכבר שטוח על גבו ורססו את הגוף הקדמי באתנול 70%. להרים את העור מעל הרחם עם מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים כירורגיים לחשוף את הרחם.
3. בזהירות להסיר את הרחם ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי מוכן בעבר על קרח.
4. באמצעות מספריים כירורגיים מתחת למכסה המנוע הלמינרי ב- RT, הסר בזהירות את העוברים מהרחם. מוציאים את כל שאריות השליה מהעוברים בעזרת מלקחיים ומניחים אותם בצלוחית פטרי חדשה בקוטר 10 ס"מ מלאה בחיץ של דולבקו.
5. באמצעות מלקחיים או מחטים, חתכו את החלק האחורי של הראש מהמקומות המסומנים בחצים שחורים באיור 1A. הרחיקו את החתיכה החתוכה משאר העובר (איור 1B).
6. הניחו את החלק האחורי של החתיכה החתוכה לכיוון הצופה (איור 1C) וחתכו אותה בעדינות מקאודלית לגולגולתית (איור 1D). מעומק של 0.5 מ"מ מתחת לפתח הגולגולת, חתכו אזור 2 מ"מ² – 3 מ"מ², כפי שמוצג באיור 1E.
7. אספו את רצפת המוח התיכון הגחוני (ראו איור 1F) בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק בנפח 1.5 מ"ל. שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח עד שכל רצפות המוח התיכון נאספות בו.
   הערה: לחלופין, ניתן לאסוף את רצפות המוח התיכון באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל לאחר דיסקציה של כל מוחות העובר.

3. הקמת תרביות עובריות ראשוניות מעוברי עכבר E13.5 בפורמט צלחת באר 96

1. לאחר איסוף רצפות המוח התיכון מכל העוברים באותו צינור של 1.5 מ"ל, הסירו את שאריות החיץ של דולבקו ושטפו את חתיכות הרקמה שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ללא Ca2⁺, Mg2⁺.
2. הסר HBSS והוסף 500 μL של 0.5% טריפסין לצינור. לדגור אותו ב 37 ° C במשך 30 דקות.
3. במהלך הדגירה, חם 1.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ב 37 ° C, להוסיף 30 μL של DNase I ל- FBS, ולערבב. כמו כן, לטש באש את קצה פיפטת זכוכית סיליקון. ודא כי החור אין קצוות חדים והוא בערך באותו גודל כמו 1 מ"ל micropipette tip.
   הערה: כחלופה, קצה מיקרופיפטה 1 מ"ל הדבקה נמוכה יכול לשמש לטריטורציה. עם זאת, פיפטות זכוכית סיליקון נראה לתת את התוצאות הטובות ביותר.
4. ברגע שהדגירה בשלב 3.2 מסתיימת, הוסף 500 μL של תערובת FBS/DNase לרקמה המעוכלת חלקית. השתמש פיפטה זכוכית כדי triturate את הרקמה בתערובת FBS / טריפסין. עשו טריטורציה עד שהרקמות יתנתקו לחלקיקים זעירים שבקושי נראים לעין. הימנע מבועות במהלך טריטורציה.
5. תן לחלקיקים שנותרו לזרז בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה על ידי כוח הכבידה. מבלי לשנן את המשקע בתחתית, לאסוף את supernatant לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי ריק 15 מ"ל.
6. דילל FBS/DNase I משלב 3.3 (98:2) עם 1,000 מיקרוליטר HBSS כדי להשיג FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). מערבבים על ידי פיטינג למעלה ולמטה. הוסיפו 1,000 מיקרוליטר של התערובת החדשה לחלקיקים שנותרו בצינור המיקרוצנטריפוגה. נסה שוב וחזור על שלב 3.5.
7. חזור על השלב הקודם פעם נוספת כדי להשתמש בכל FBS/ DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. לאחר שכל הסופרנאטנט נאסף בתוך צינור 15 מ"ל (משלבים 3.5, 3.7 ו-3.8), השתמש בצנטריפוגה שולחנית כדי לסובב את הסופרנאטנט (~3 מ"ל) במהירות של 100 x גרם, למשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט מבלי לגעת בתאים הכדוריים בתחתית.
9. שטפו את כדורית התא על ידי הוספת 2 מ"ל DPM לצינור וסובבו אותה ב 100 x גרם למשך 5 דקות. הסירו את הסופרנאטנט וחזרו על הכביסה 2x כדי למזער את הלכלוך בתאים הכדוריים.
   הערה: השתמשו תמיד ב-DPM טרי ומחומם עבור תאי העצב בתרבית. עבור שלבי הכביסה, DPM לא צריך להיות טרי, אבל צריך להיות מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
10. לדלל את התאים עם DPM טרי וחם ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה. כמות DPM לדילול תלויה במספר העוברים המשמשים לדיסקציה של רקמות. לדוגמה, השתמש ב- 150 μL של DPM כדי לדלל את התאים המתקבלים מעשרה עוברים.
11. העברת 10 μL של תאים ב- DPM לצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים אותם עם 10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן. ספירת תאים חיים (כלומר, Trypan blue negative) באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
    הערה: השתמש 30,000 תאים עבור ציפוי לכל באר כדי לקבל ~ 1,000 נוירונים דופמין לכל באר. אם צפיפות התא גבוהה מ~30,000 תאים ל-6 מיקרוליטר, יש לדלל עוד יותר את התאים עם DPM לפני הציפוי, כך שנפח הזריעה לא יפחת מ-6 מיקרוליטר.
12. מבלי לגעת בתחתית הבארות, הסר את ה- DPM מאיי המיקרו שנוצרו בשלב 1.6.
13. על מנת לקבל צפיפות תאים ניתנת לשחזור בכל באר, מערבבים את התאים על ידי פיפטינג עדין לפני ציפוי בבאר. עם מיקרופיפטה של 1-10 μL, מוסיפים 6 μL של תאים למרכז הבאר, במיקום של כל אי מיקרו לשעבר.
14. מלאו את הבארות הריקות בשולי הצלחת ב-150 מיקרוליטר מים או 1x PBS כדי למזער אידוי מהבארות המכילות תרביות עצביות. לדגור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 1 שעות.
15. לאחר שעה מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, מוסיפים 100 מיקרוליטר DPM לכל באר עם תאים ומחזירים אותה לאינקובטור.
16. יומיים לאחר הציפוי (יום במבחנה 2, או DIV2), להסיר 25 μL ולהוסיף 75 μL של DPM טרי כדי להביא את נפח המדיה הסופי ל 150 μL ולמנוע אידוי ככל האפשר.
17. החליפו מחצית מהבינוני ב-DPM טרי (כלומר, הסירו 75 מיקרוליטר והוסיפו 75 מיקרוליטר DPM טרי) ב-DIV5. אל תבצע שינויי מדיה לאחר DIV5.

תוצאות

איור 1: דיסקציה של רצפת המוח התיכון מעובר עכבר E13.5. (A) מיקומי חיתוך בחלק האחורי של הראש מסומנים בחצים שחורים ובקווים מקווקווים לבנים. (B) החתיכה הוצאה משאר העובר. החתיכה שהוסרה מעוגלת. (C) היצירה הופנתה ב-90° כדי לפנות לאחור לכיוון הצופה. (D) היצירה נפתחה מהחצים השחורים, מהקאודליים לגולגולתיים (מסומנים בקו מקווקו לבן). (E<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4% טריפאן כתם כחול	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	15250061
15 מ"ל CELLSTAR צינור פוליפרופילן	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, גרמניה	188261
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	10236276001
5 מטר הידרוכלור	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
5 מטר נאוה	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
ViewPlate עם 96 בארות (שחור)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ארה"ב	6005182
99.5% אתנול (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, פינלנד	לא ישים
AquaSil נוזל סיליקון	Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	TS-42799
צינור מיקרוצנטריפוגה Autoclaved 1.5 מ"ל	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
התקן סוניקציה Bioruptor	Diagenode, Liege, בלגיה	B01020001
Ca2+, Mg2+ חינם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	14175-053
חבילות התוכנה CellProfiler ו-CellAnalyst	לא ישים	לא ישים	תוכנת קוד פתוח בחינם
צנטריפוגה 5702	Eppendorf AG, Hamburg, גרמניה	5702000019
חממת CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	לא ישים
תא ספירה	BioRad Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב	1450015
מיקרוסקופ DeltaVision ברזולוציה גבוהה במיוחד עם שולחן אוויר וארון	GE Healthcare Life Sciences, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I)	Roche, Basel, שוויץ	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	21331–020
החיץ של דולבקו	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב	10500056
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	G8769
מלח חיץ זרחן (PBS)	לא ישים	לא ישים	מטבח מדיה, המכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי
פרימוצין	InvivoGen, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב	ANT-PM-1, ANT-PM-2
פולי-L-אורניתין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	עמ' 4957
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	11332481001
טריפסין	MP Biomedicals, Valiant ושות', Yantai, שאנדונג, סין	2199700