דיסקציה והרכבה של זחלי זבוב פירות צמחי מוח

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. ניתוח והרכבה של צמחי מוח זחלים

1. נתח את מוחות הזחלים בתמיסת מלח חיצונית פיזיולוגית (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM גלוקוז, 10 mM סוכרוז, 5 mM N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid (TES), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7.2) תחת מיקרוסקופ דיסקציה (4.5x הגדלה כוח) עם שני זוגות של #5 מלקחיים סטנדרטיים קצה (11 ס"מ). השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את גוף הזחל במקומו ובזוג השני כדי לנתח בזהירות את המוח. שמור על דיסקי העין, אונות המוח וחוט העצב הגחוני. הסר את השרירים המחוברים כדי למזער את תנועות הדגימה במהלך ההדמיה.
2. הכינו שקופית זכוכית (25 x 75 x 1.0 מ"מ³) והשתמשו במזרק כדי לצייר תא מרובע עם שומן ואקום.
3. הוסף 20 μL של תמיסת מלח חיצונית לתא המרובע עם מחסומי שומן.
4. העבירו מוחות זחלים מנותחים לתוך התא במגלשת הזכוכית באמצעות מלקחיים. התאימו את מיקום המוח מתחת לטווח הדיסקציה כדי להבטיח שהצד הגבי פונה כלפי מעלה.
5. כסו את התא במשטח כיסוי זכוכית (22 x 22 x 0.15 מ"מ³). מוח הזחל מורכב כעת על המגלשה בתוך תא מלא בתמיסת מלח חיצונית (איור 1B).
   הערה: לחיצה עדינה על הכיסוי מגבילה את המוח ומפחיתה את היסחפות הדגימה בסשן ההדמיה שלאחר מכן.

איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקול הדמיה וכימות של דינמיקת דנדריטים. (A) הפרוטוקול מכיל שישה שלבים המכסים הכנת דגימה, איסוף תמונות, עיבוד תמונה וכימות אוטומטי למחצה של דינמיקת דנדריטים. (B) תרשים סכמטי המדגים תא הדמיה המכיל צמח מוח זחל המורכב עם הצד הגבי כלפי מעלה. לצמח המוח יש נוירון גחוני צדדי (LNv) המסומן בנפרד בכל אונה, והוא שקוע בתמיסת המלח החיצונית. מחסומי השומן בוואקום תומכים במשקל הכיסוי ויוצרים תא קטן המונע מהמוח לנוע.