התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי אב עצביים

תקציר

מקור: Phillips, A. W., et al. פיתוח גופי עובר חופשיים מסרום HiPSC לחקירת תרביות תאי גזע תלת-ממדיות באמצעות בדיקות רלוונטיות פיזיולוגית. J. Vis. Exp. (2017).

הסרטון מדגים טכניקה להבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) לתאי אב עצביים (NPCs). בתחילה, hiPSCs הם תרבית על שכבת הזנה של פיברובלסטים עובריים עכבר (MEFs). לאחר מכן, התאים מנותקים ומועברים לצלחת מצופה ביופולימר כדי לאפשר ל-MEFs להיצמד ולהיפרד מה-hiPSCs. לאחר מכן מועברים ה-hiPSCs המרחפים ללוח V תחתון וצנטריפוגות ליצירת אגרגטים. לבסוף, הוספת מדיום בידול גורמת להתמיינות של hiPSCs בתוך המצרף לתוך NPCs.

פרוטוקול

1. יצירת תאי אב עצביים

1. שמור על hiPSCs שמקורם בפיברובלסטים ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בצלחות של 6 בארות על שכבת תא מזין עוברי עכבר (MEF) המוקרן γ בתווך iPSC אנושי בתוספת מולקולות קטנות.
   הערה: תחזוקה יומית היא גרסה שונה של הליכים שדווחו בעבר.
   1. צלחת 6 x 10⁵ MEFs על כל באר של צלחת כיתה תרבית רקמה 6 בארות ב 300 μL / בינוני מומלץ היטב (בהתאם לפרוטוקול היצרן).
   2. לאחר 48 שעות, החלף MEFs בינוני עם 300 μL/well hiPSC בינוני למשך שעה אחת לפני הוספת hiPSCs.
   3. הפשיר במהירות hiPSCs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והוסף באיטיות 1 מ"ל hiPSC בינוני טיפה. מעבירים את hiPSCs ובינוני לצינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף בינוני כדי להביא את הנפח הכולל ל 5 מ"ל. צנטריפוגה למשך 4 דקות ב 129 x גרם, לשאוף את supernatant, בעדינות resuspend את הגלולה בתווך hiPSC 1 מ"ל עם מעכב חלבון קינאז הקשור Rho (ROCK) בריכוז 1:1,000.
   4. לוחים את תרחיף התא (בדרך כלל נזרע ב 300,000 תאים / באר) על שכבת תא MEF ודגור ב 37 ° C, 5% CO₂, 95% לחות.
   5. עקוב מקרוב אחר תרבית iPSC באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר 48 שעות, הסר תרביות שיש להן קצוות לא אחידים, גדלו להיות דמויי ציסטיות או נראות צהבהבות-חומות תחת מיקרוסקופ האור כדי למזער התמיינות ספונטנית.
      הערה: לאחר 7 - 10 ימים, מושבות hiPSC צריך להיווצר. מושבות צריכות להיות עגולות, עם גבולות מוגדרים בבירור וצפיפויות תאים אחידות, וללא תאים לא אחידים ארוזים באופן רופף.
   6. בחר ידנית מושבות hiPSC עגולות כדי לנקות את התרבית של תאים ממוינים באופן ספונטני. הרחיבו את המושבות על ידי הצבתן על שכבות MEF טריות. יש להרחיב ביחס של 1:3 כל 7 ימים כאשר התרביות מתקרבות למפגש וקופאות.
2. לאחר הרחבה והקפאת תאים (לגיבוי), מגדלים מושבות hiPSC על לוחות עד שהן מגיעות למפגש של 50-75%.
3. שבעה ימים לאחר הציפוי, השתמש בטיפול אנזימטי עדין (5-10 דקות עם 300 μL של תמיסת אנזים) וטריטורציה עדינה (2-4 פעמים עם 1,000 μL pipet) כדי לקצור ולהכין hiPSCs עבור התמיינות תאים מבשר עצבי.
4. צנטריפוגו את מתלה התא ב 129 x גרם במשך 4 דקות, לשאוף את supernatant, ולהשהות מחדש את הגלולה בתווך iPSC אנושי 5 מ"ל. העבירו את תרחיף התא לצלחת תרבית תאים בקוטר 5 ס"מ מצופה ג'לטין 0.1% למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C כדי לסלק MEFs ולמקסם את תפוקת hiPSC. מעבירים את המדיום (עם תאים לא נצמדים) לצלחת נוספת מצופה ג'לטין בקוטר 5 ס"מ.
5. מעבירים את התאים הלא נדבקים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל באמצעות צינור העברה. שטפו בעדינות את הצלחות עם 3 מ"ל בינוני והוסיפו אותו לצינור 15 מ"ל.
6. צנטריפוגו את מתלה התא ב 129 x גרם במשך 4 דקות, לשאוף את supernatant, ובעדינות להשהות את הגלולה בתווך. קבע את ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. צלחת 9,000 תאים/באר בלוח תחתון V בעל הדבקה נמוכה של 96 בארות.
7. צנטריפוגה את הצלחת ב 163 x גרם במשך 3 דקות. לדגור את הצלחת ב 37 ° C, 95% לחות ו 5% CO₂. באמצעות פיפטה, החליפו 50% מדיום אחת ליומיים על ידי הסרת מחצית המדיום והחלפתו בתווך מבדיל טרי המוגדר כימית 1 (DM1; איור 1; טבלת חומרים) למשך 14 יום.

תוצאות

איור 1: תרשים סכמטי המתאר את השלבים המוקדמים בהכנת SFEBs. לאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נקצרים באמצעות דיסוציאציה אנזימטית, הם מצופים בצלחות של 96 בארות וצנטריפוגות במהירות של 163 x גרם למשך 3 דקות כדי לגרום לצבירה מהירה. לאחר 14 יום במבחנה (DIV) ניתן להעביר צברי תאים מלוחות 96 בארות באמצעות פיפטים רחבים אל לוחות תרבית תאים המכילים 6 בארות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SFEB התמיינות עצבית תרבית תאים מדיה. ריאגנטים. רכיבים
STEMdiff Neural Induction Medium (מדיה hiPSC)	טכנולוגיות STEMCELL	0-5835	250 מ"ל
PluriQ ES-DMEM בינוני (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
רכיבי מדיה DM1
D-MEM/F-12 (1X), נוזל גלוטמקס, 1:1	Invitrogen	10565018	385 מ"ל
תחליף סרום נוקאאוט	Invitrogen	10828028	20% 100 מ"ל
עט/סטרפ	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
גלוטמקס 200mM	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM 10 mM (100X), נוזל	Invitrogen	11140050	5 מ"ל
2-מרקפטואתנול (1,000X), נוזל	Invitrogen	21985023	900 ש"ח
מולקולות קטנות
Y27632 (ROCKi)	סטמג'נט	04-0012-10	10uM
רכיבים/חומרים
פיברובלסטים עובריים של עכבר	GlobalStem	GSC-6301G
96 באר V תחתון עם מכסים	ירוקי	222-8031-01V
מגיב דיסוציאציה של תאי StemPro Accutase	תרמופישר	A1110501
6 תחתונים שטוחים היטב	בז	353046