פיתוח ותחזוקה של גופים עובריים ללא סרום

תקציר

מקור: Phillips, A. W., et al. פיתוח גופי עובר חופשיים מסרום HiPSC לחקירת תרביות תאי גזע תלת-ממדיות באמצעות בדיקות רלוונטיות פיזיולוגית. J. Vis. Exp. (2017).

הסרטון מתאר את ההליך לפיתוח גופים עובריים נטולי סרום (SFEBs) מתאי אב עצביים באמצעות אמצעי התמיינות שונים ללא סרום או DM. DM-2 מקל על הבשלת תאי העצב וסידור שלהם ליצירת SFEBs, בעוד DM-3 משמש לתחזוקת גדילה נוספת.

פרוטוקול

1. השראת גוף עוברי ללא סרום (SFEB) (איור 1)

1. מניחים תרבית תאים בגודל 40 מיקרומטר לתוך לוחות בעלי 6 בארות ומוסיפים 1 מ"ל מדיום התמיינות 1 (DM1) (טבלת חומרים) לפחות שעה אחת לפני הוספת אגרגטים.
2. העבר את צברי תאי האב העצביים עם מדיום 20 μL באמצעות קצה פה רחב של 200 μL על תוספות תרבית תאים של 40 מיקרומטר ושנה את המדיום ל- DM2 (טבלה של חומרים).
   הערה: תוספות תרבית תאים הן תוספות מיוחדות היושבות מעט מתחתית הבאר ומורכבות מקרום פוליטטרה-פלואוראתילן התלוי על מסגרת פלסטיק. קרום זה תואם ביולוגית ויכול לקיים ביעילות העברת חומרים מזינים וחמצן ל- SFEBs המונחים למעלה. הם משמשים בדרך כלל עם תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות שנלקחו מעכבר או חולדה.
   1. מעבירים 4-6 אגרגטים לתרבית תא אחת, מכניסים ומאפשרים מרווח מספיק בין האגרגטים. הסר כמה שיותר תמיסה עודפת באמצעות קצה פיפטה דק (למשל, קצה 200 μL).
      הערה: מקובל להפריע לזמן קצר ל- SFEB מכיוון שהם ינועו על תוספת תרבית התאים כאשר התמיסה מוסרת מרחבי SFEBs.
   2. שמור על התרביות ב 1 מ"ל של DM2 ב 37 ° C, 95% לחות ו 5% CO2. באמצעות פיפטה, לשנות 75% של המדיום כל יומיים על ידי הסרת שלושה רבעים של המדיום ולהחליף אותו עם שלושה רבעים מדיום טרי. לדוגמה, להסיר 750 μL של בינוני ולהוסיף 750 μL של מדיום טרי.
3. לאחר 14 ימי תרבית, עברו למדיום DM3 (טבלת חומרים) עם שינוי בינוני של 75% כל יומיים ולמשך 16 ימים נוספים.
4. כדי לשמור על SFEBs על תוספות תרבית תאים מעבר ל -30 יום, לשנות את המדיום כל יומיים במשך 60, 90, ו 120 ימים.
   הערה: ה-SFEBs יגדלו לקוטר של כ-1,000 מיקרומטר ועוביים בדרך כלל 100-150 מיקרומטר.
5. נתקו את ה-SFEBs מהחדרה על ידי פישוט עדין של המדיום באמצעות קצה פיפטה רחב של 200 μL. כדי להעביר את ה-SFEBs, השתמשו בקצה פיפטה רחב פה כדי לשאוב בעדינות את הגופות לתוך קצה הפיפט. לאחר העמסת SFEB לקצה הצינור, מעבירים בעדינות לצלחות של 12 בארות ושוטפים עם 300 מיקרוליטר מלח חוצץ פוספט (PBS) לכל באר.

תוצאות

איור 1: ציר הזמן של שינויים ושלבים בינוניים במהלך הצמיחה וההתרחבות של SFEB.

לאחר ש-SFEBs הועברו לתוספות, הם עוברים שני שינויים בינוניים לאחר 14 ו-28 ימים במבחנה (DIV). הם בדרך כלל נקטפים לניסויים ב DIV 30, 60, ו 90. כניסות עליונות מציגות שלבים שונים בתהליך זה. פסי קנה מידה = 1,000 מיקרומטר (שמאל קיצוני); 1,000 מיקרומטר (DIV 20); 600 מיקרומטר (DIV 30); ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SFEB התמיינות עצבית תרבית תאים מדיה. ריאגנטים. רכיבים
STEMdiff Neural Induction Medium (מדיה hiPSC)	טכנולוגיות STEMCELL	0-5835	250 מ"ל
PluriQ ES-DMEM בינוני (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
רכיבי מדיה DM1
D-MEM/F-12 (1X), נוזל גלוטמקס, 1:1	Invitrogen	10565018	385 מ"ל
תחליף סרום נוקאאוט	Invitrogen	10828028	20% 100 מ"ל
עט/סטרפ	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
גלוטמקס 200mM	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM 10 mM (100X), נוזל	Invitrogen	11140050	5 מ"ל
2-מרקפטואתנול (1,000X), נוזל	Invitrogen	21985023	900 ש"ח
רכיבי מדיה DM2
D-MEM/F-12 (1X), נוזל גלוטמקס, 1:1	Invitrogen	10565018	500 מ"ל
גלוטמקס 200mM	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
עט/סטרפ	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
תוסף N-2 (100X), נוזל	Invitrogen	17502048	10 מ"ל
רכיבי מדיה DM3
NEUROBASAL בינוני (1X), נוזל	Invitrogen	21103049	500 מ"ל
תוסף B-27 פחות ויטמין A (50X), נוזלי	Invitrogen	12587010	10 מ"ל
גלוטמקס 200mM	Invitrogen	35050061	5 מ"ל
עט/סטרפ	Invitrogen	15140122	5 מ"ל
רכיבים/חומרים
	מיליסל	PICM0RG50
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמופישר	10010023	500 מ"ל