בניית מעגלים עצביים בתבנית על מערך מרובה אלקטרודות

תקציר

מקור: Kanner, S., et al. תכנון, טיפול פני שטח, ציפוי תאי וטיפוח של רשתות עצביות מודולריות המורכבות ממעגלים פונקציונליים המחוברים זה לזה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את התהליך של תרבית תאים עצביים במערך רב-אלקטרודות בתבנית (MEA) כדי ליצור רשתות עצביות מודולריות. שיטה זו מאפשרת ללמוד העברת אותות עצביים ואינטראקציות תאיות.

פרוטוקול

1. הכנת מערך מרובה אלקטרודות (MEA)

1. נקי MEA בסדר זה (טבלת חומרים):
   1. יש לשטוף במים מתחת לברז ולהסוניק בחומר ניקוי מרוכז ואנזימטי 3 פעמים.
   2. סוניק במים מזוקקים 3 פעמים.
   3. יש לשטוף במים מזוקקים (במכסה המנוע, 1,000 μl tip) במשך 3 פעמים ולהניח תחת אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
2. הכנת רשת תומכת:
   1. הכן את תבנית רשת התמיכה המתוכננת.
      1. יוצקים פולידימתילסילוקסאן (PDMS) לצלחת בעלת 12 בארות (קוטר 22 מ"מ).
      2. כאשר PDMS מתקשה, להסיר את התבנית, באמצעות אזמל, לחתוך חור באמצע כדי ליצור צורה טבעת.
      3. הניחו תבנית רשת תמיכה מתוכננת במרכז MEA (איור 1A) וכסו את שאר פני השטח בפולי-D-ליזין (PDL) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT).
   2. יש להסיר את ה-PDL באמצעות פיפטה ולשטוף במים מזוקקים.
   3. הסירו את התבנית והניחו לה להתייבש (איור 1A).
3. יישור סטנסיל לאזור MEA באופן הבא:
   1. מניחים את השבלונה על המיקרומניפולטור הייעודי. השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי ליישר במדויק את המבנה המעוצב לאלקטרודות והנמיכו את השבלונה עד שהיא ממוקמת על משטח MEA (איור 1B).
      הערה: מגע עם MEA נקי היטב מספק הידבקות תחרותית בין PDMS לבין MEA עצמו.
   2. הרימו את המיקרומניפולטור, ואם יש צורך, השתמשו בפינצטה כדי להפעיל כמות קטנה של לחץ מעל ה-PDMS כדי למנוע ממנו להתנתק מה-MEA.
   3. לחצו בעדינות על השבלונה אל משטח MEA, והשתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שהיא מחוברת היטב ומיושרת היטב (איור 1C-D).
4. הכניסו את MEA לתא ואקום למשך 15 דקות; שימו טיפה של 1 מ"ל PDL על השבלונה.
5. הכניסו לתא הוואקום פעמיים למשך 20 דקות כל אחת. השאירו את PDL להתייבש באינקובטור.
6. לפני הציפוי, הסר את שבלונות PDMS מ- MEAs ושטוף אותן באמצעות מים סטריליים. יש להניח תחת תאורת UV למשך 7 דקות.

2. ציפוי

1. חישוב מספר התאים הדרושים לציפוי באמצעות המוציטומטר
   1. יש לוודא שתא הספירה (המוציטומטר) נקי ולהניח עליו מכסה (השתמש באלכוהול לניקוי).
   2. לדלל 10 μl של תרחיף התא ב 190 μl של ציפוי בינוני (דילול 1: 20).
   3. העמיסו 10 μl של התאים המדוללים על קצה תא הספירה ושפכו את התאים החוצה באיטיות, מה שמאפשר לתא למלא את עצמו.
   4. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לדמיין את רשת hemocytometer. לקבוע את מספר התאים בחדר על ידי ספירה ישירה (תאים בריאים צריכים להיות עגולים). ספרו את התאים בתוך הריבוע הגדול מבלי שאלה יחצו את הקצוות.
   5. חישוב ריכוז התאים:
      המספר הכולל של תאים/1000 μl = סך כל התאים שנספרו × גורם דילול × 10⁴ (שטח ההמוציטומטר).
      הערה: לדוגמה, אם גורם הדילול היה 20 וסך התאים שנספרו היה 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0.1 x 10⁷ תאים / 1,000 μl או 1 x 10⁶/100 μl. על מנת צלחת 0.75 x 10⁶ תאים, להוציא 75 μl מתוך התאים.
2. קחו את מספר התאים הדרושים לציפוי לכל צלחת MEA או פטרי בודדת, השהו מחדש את התאים כדי למנוע צבירה, והניחו אותם במרכז, על גבי האזור המעוצב (ניתן לדלל את התאים בתווך במידת הצורך). עבור MEA, הניחו טיפה של 100 μl באמצע. עבור הכיסוי, הניחו טיפה של 1,000 μl באמצע.
3. יש לדגור על התאים המצופים בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות. להוסיף אמצעי ציפוי לתאים המצופים, עד 1 מ"ל לכל MEA ו-2 מ"ל לכל כיסוי.
4. יש לשמור על טמפרטורה של 37°C ולדלל במדיום צמיחה טרי מועשר ב-0.5 Pen-Strep, 2% B-27 ו-0.75% גלוטמקס כל 4 ימים.
5. מ 6/7 DIV, לאחר שרואים קשרים בין האיים, לדלל בינוני עם 10 μl/ml FUDR (25 מ"ג deoxyuridine + 62.5 מ"ג uridine ב 12.5 מ"ל MEM (מינימום חיוני בינוני Eagle)) או כל סוכן אנטי מיטוטי אחר כדי למנוע צמיחת יתר של גלייה.

תוצאות

איור 1. תצהיר מבני PDMS על MEA. (A) תבנית PDMS עם צורת טבעת (מסומנת בחץ אדום) המורכבת על MEA. התבנית משמשת לציפוי האזור המיועד לרשת העצבית התומכת וממוקם בשולי אזור הגידול (זה מוגבל על ידי הטבעת המותקנת על MEA ומסומנת על ידי החץ הירוק). (B) יישור שבלונה של PDMS באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה באמצעות מיקרומניפולטור. (C) סטנסיל PDMS שהופקד באזור המזרח התיכון וצפון א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PDMS, סילגארד 184	דאו קורנינג
תא ואקום Nalgene	תרמו	5305-0609
פולי-די-ליזין PDL	סיגמא	P7886
12 צלחת תרבות באר	סיגמא	CLS3336
5-פלואורו-2'-דאוקסיורידין	סיגמא	F0503
MEA1060-INV-BC	מערכות רב ערוציות
TC02	מערכות רב ערוציות
Pen Strep	תעשיות ביולוגיות בית העמק	03-033-1ג
B-27	גיבקו	17504044
גלוטמקס	גיבקו	35050-038
MEM מינימום חיוני בינוני-איגל	תעשיות ביולוגיות בית העמק	01-025-1B
מיקרו אלקטרודות מערכים 4Q	מערכות רב ערוציות	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	מדריך ניקוי: http://www.multichannelsystems.com