התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים מהונדסים המושרים על ידי בני אדם לנוירונים מוטוריים פונקציונליים

תקציר

מקור: Garone, M. G., et al. המרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) לנוירונים מוטוריים תפקודיים בעמוד השדרה ובגולגולת באמצעות וקטורים של PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מציג את התהליך של התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים מוטוריים אנושיים לתאי עצב מוטוריים. הרציונל כולל שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שהונדסו גנטית כדי לבטא גורמי שעתוק ספציפיים. כאשר תרבית במדיה המכילה דוקסיציקלין, אנטיביוטיקה זו מעוררת ביטוי של גורמי שעתוק, ובכך מקדמת התמיינות iPSC לאבות נוירונים מוטוריים. בסופו של דבר, האבות מתורבתים בתווך עצבי כדי להניב נוירונים מוטוריים בוגרים ומתפקדים.

פרוטוקול

1. תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים

1. הכנת לוחות מצופים מטריצה
   1. הפשירו בקבוקון אחד של מטריצה בנפח 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. מניות המטריצה המקוריות מגיעות בריכוזי מניות שונים, וציטוטים אליציטוטים נעשים על פי גורם הדילול המצוין בגיליון הנתונים והם ספציפיים למגרש הבודד. חשוב לשמור על הבקבוקון והצינורות קרים כקרח כדי למנוע ג'ל מוקדם מדי של המטריצה. יש לפזר את המטריצה לתוך aliquots ב cryotubes מצוננים מראש על קרח. להקפיא aliquots שאינם בשימוש ב -20 °C.
   2. מניחים אליקוט אחד על קרח למשך כשעתיים להפשרה.
   3. לדלל את aliquot של המטריצה עם 20 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוטי 50 מ"ל.
   4. מערבבים היטב ומחלקים 1 מ"ל של מטריצה מדוללת לכלים של 35 מ"מ (כמויות שוות ערך לכל שטח פנים של מנות אחרות).
   5. שמור את הכלים המכילים מטריצה מדוללת למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ציפוי.
      הערה: כלים, אטום עם parafilm, ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.
2. הכנת תמיסת מלאי (20 מ"ל) ו 1x עובד aliquots של מגיב דיסוציאציה תאים עדין (ראה טבלה של חומרים).
   1. יש להמיס אבקה ל-10 מ"ג/מ"ל ב-PBS (ללא Ca²⁺/Mg²⁺)
   2. יש לעקר את המסנן דרך קרום מסנן בגודל 0.22 מיקרומטר.
   3. הכינו 20 aliquots (1 מ"ל כל אחד) ולאחסן אותם ב -20 °C.
   4. לפני השימוש, יש לדלל aliquot אחד ב-PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ חינם) ל-1 מ"ג/מ"ל (1x aliquots עובד).
      הערה: 1x עובד aliquots ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 2 שבועות.
3. העברת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים.
   1. לפני שמתחילים: אם מאוחסנים בטמפרטורה של 4°C, יש לחמם מראש את הלוחות המצופים במטריצה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 20-30 דקות. לחמם מראש בטמפרטורת החדר את כמות iPSC medium האנושית (ראו טבלת חומרים) הדרושה. חממו מראש את ה-DMEM/F12.
   2. שאפו למדיום תרבותי.
   3. יש לשטוף iPSCs עם PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ חינם).
   4. הוסף תמיסת דיסוציאציה עדינה אחת (0.5 מ"ל לצלחת 35 מ"מ). דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתנתק מהצלחת, בדרך כלל 3-5 דקות.
   5. שאפו לפתרון הדיסוציאציה העדין, היזהרו שלא לנתק מושבות iPSC.
   6. לשטוף את התאים עם DMEM/F12 (2 מ"ל עבור צלחת 35 מ"מ) ולשאוף, נזהר לא לנתק את התאים. חזור על שלב זה פעם נוספת.
   7. הוסף iPSC בינוני אנושי (1 מ"ל לצלחת 35 מ"מ).
   8. מנתקים בעדינות את המושבות בעזרת מרים תאים ומעבירים אותן לצינור של 15 מ"ל.
   9. שברו בעדינות גושי תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטור P1000 3-4 פעמים.
   10. שאפו את הסופרנאטנט מהלוח(ים) המצופים במטריצה.
   11. זרעו את התאים בנפח התרבית המתאים של מדיום iPSC האנושי. יחס הפיצול יכול להשתנות מקו לקו והוא בערך 1:4-1:8. שנה את המדיום מדי יום.

2. יצירת קווי iPSC אינדוקטיביים NIL ו- NIP

1. טרנספקציה של תאים
   1. שטפו את התאים עם PBS (ללא Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) (0.35 מ"ל עבור צלחת 35 מ"מ) ודגור ב 37 ° C עד תאים בודדים מופרדים (5-10 דקות).
   3. השלם בעדינות את הפרדת התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטור P1000 3-4 פעמים.
   4. יש לאסוף בצינור של 15 מ"ל ולהוסיף PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ חינם) ל-10 מ"ל. ספור את התאים.
   5. גלולה 10⁶ תאים ומשהה מחדש ב 100 μl של חיץ R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא; ראה טבלת חומרים).
   6. הוסף DNA פלסמיד עבור transfection: 4.5 מיקרוגרם של וקטור transposable (epB-Bsd-TT-NIL או epB-Bsd-TT-NIP12) ו 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד transposase piggyBac.
   7. הדבקה במערכת אלקטרופורציה של התא (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן וכפי שתואר קודם לכן עם הפרמטרים הבאים: מתח 1,200 וולט, רוחב 30 אלפיות השנייה, פעימה אחת. זרעו את התאים בתווך iPSC אנושי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (מעכב רוק, ראו טבלת חומרים) בצלחת מצופה מטריצה בקוטר 6 מ"מ.
2. בחירה עם אנטיביוטיקה
   1. יומיים לאחר ההדבקה, יש להוסיף 5 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין למדיום התרבית.
   2. רוב התאים שאינם נגועים ימותו תוך 48 שעות מרגע בחירת הבלסטיצידין. שמור את התאים בבלסטיצידין לפחות 7-10 ימים כדי לבחור את התאים שלא שילבו את הטרנסגנים בגנום.
   3. לשמור על תאים נגועים יציבים כאוכלוסייה מעורבת, המורכבת מתאים עם מספר שונה של טרנסגנים ואתרי אינטגרציה שונים, או לבודד שיבוטים בודדים.
   4. הכינו מנה נוספת כדי לבדוק ביטוי יעיל של הטרנסגנים על 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין אינדוקציה על ידי RT-PCR עם פריימרים ספציפיים לטרנסגן עבור Ngn2 (קדימה: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; הפוך: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. בשלב זה, יש להקפיא את המלאי של קווי NIL- ו-NIP-iPSC החדשים בתווך הקפאה עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (ראו טבלת חומרים).

3. התמיינות נוירונים מוטוריים

1. נתק את התאים עם מגיב דיסוציאציה של תאים כמתואר (שלבים 2.1.1.-2.1.3). לאסוף תאים מנותקים בצינור 15 מ"ל ולדלל עם 5 נפחים של DMEM/F12. גלול את התאים והשהה מחדש בתווך iPSC אנושי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. ספרו את התאים והזרעים על כלים מצופים מטריצה בצפיפות של 62,500 תאים לסמ"ק².
2. למחרת, החליפו את המדיום ב-DMEM/F12, בתוספת 1x אנלוג L-גלוטמין יציב, 1x תוסף תרבית תאים של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) ו-0.5x פניצילין/סטרפטומיצין, המכיל 1 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין. זה נחשב כיום 0 של בידול. ביום הראשון, רעננו את המדיום ואת הדוקסיציקלין.
3. ביום השני, יש לשנות את המדיום ל-Neurobasal/B27 medium (Neurobasal Medium בתוספת 1x B27, 1x L-גלוטמין אנלוגי, 1x NEAA ו-0.5x פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ו-1 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין (ראו טבלת חומרים). לרענן את המדיום ואת דוקסיציקלין כל יום עד יום 5.
4. יום 5: דיסוציאציה של תאים עם מגיב דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים).
   1. שטפו את התאים עם PBS (ללא Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים (0.35 מ"ל עבור צלחת 35 מ"מ) ודגור ב 37 ° C עד שכל monolayer התא נפרד מן המנה.
      שים לב שתאים בודדים לא יופרדו במהלך הדגירה.
   3. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 ואסוף את התאים בצינור של 15 מ"ל.
   4. השלם בעדינות את הפרדת התאים על-ידי פיפטציה מעלה ומטה עם פיפטור P1000 10-15 פעמים.
   5. הוסף 4 מ"ל של DMEM/F12 וספור את התאים.
   6. בשלב זה, יש להקפיא אבות של נוירונים מוטוריים בתווך הקפאת תאים (ראו טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
   7. גלול את התאים והשהה מחדש בתווך עצבי (Neurobasal/B27 medium בתוספת 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF ו-200 ng/mL L-חומצה אסקורבית, ראה טבלת חומרים) בתוספת מעכב ROCK 10 μM.
   8. זרעו את התאים על פולי-אורניתין/למינין- או לחילופין על תמיכות מצופות מטריצה בצפיפות של 100,000 תאים/ס"מ². השתמש בתמיכות פלסטיק μ-Slide עם כיסוי פולימרי (ראה טבלת חומרים) לניתוח צביעה חיסונית.
5. ביום 6, החליפו את המדיום למדיום עצבי טרי ללא מעכב ROCK. בימים הבאים, רענן חצי של המדיום כל 3 ימים. יש לשנות בזהירות רבה את מדיום התרבות כדי למנוע ניתוק מפני השטח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אקוטאזה	סיגמא-אולדריץ'	A6964-100ML	מגיב דיסוציאציה של תאים
B27	Miltenyi ביוטק	130-093-566	תוסף ללא סרום לתחזוקת תאי עצב
במבנקאי	Nippon Genetics	NGE-BB02	מדיום הקפאת תאים, המשמש כאן לאבות נוירונים מוטוריים
BDNF	פרפרוטק	450-02	גורם נוירוטרופי מוחי
בלסטיסידין	סיגמא-אולדריץ'	203350	אנטיביוטיקה נוקלאוזידית המעכבת סינתזת חלבונים בפרוקריוטים ואיקריוטים
BSA	סיגמא-אולדריץ'	A2153	אלבומין בסרום בקר. חומר חוסם למניעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים בבדיקות חיסוניות
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C3881	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
Corning Matrigel hESC Certified Matrix	קורנינג	354277	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
קריוסטם ACF הקפאת מדיה	תעשיות ביולוגיות	05-710-1E	מדיום הקפאה עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G5146	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
דאפט	אדיפוג'ן	AG-CR1-0016-M005	מעכב Gamma secretase
דיספסי	גיבקו	17105-041	מגיב לדיסוציאציה עדינה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
DMEM/F12	סיגמא-אולדריץ'	D6421-500ML	מדיום בסיסי לתרבית תאים
דוקסיציקלין	סיגמא-אולדריץ'	D9891-1G	משמש להשראת ביטוי טרנסגנים מווקטורים epB-Bsd-TT-NIL ו-epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	ויסל	UWWC1-DS2U	קו iPSC אנושי מסחרי
GDNF	פרפרוטק	450-10	גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה
קו HiPSC אפיזומלי של Gibco	תרמו פישר סיינטיפיק	A18945	קו iPSC אנושי מסחרי
גלוטמקס	תרמו פישר סיינטיפיק	35050038	חלופה L- גלוטמין עם יציבות מוגברת. משפר את בריאות התא.
Hepes	סיגמא-אולדריץ'	H4034	כימיקלים לתמיסות אלקטרופיזיולוגיות
חומצה L-אסקורבית	מעבדות LKT	A7210	משמש בתרבית תאים כנוגד חמצון
למינין	סיגמא-אולדריץ'	11243217001	מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
NEAA	תרמו פישר סיינטיפיק	11140035	חומצות אמינו לא חיוניות. משמש כתוסף למדיום תרבית תאים, כדי להגדיל את גדילת התאים ואת הכדאיות.
ערכת ניאון 100 μL	תרמו פישר סיינטיפיק	MPK10096	ערכת אלקטרופורציה של תאים
מערכת העברת ניאון	תרמו פישר סיינטיפיק	MPK5000	מערכת אלקטרופורציה של תאים
מדיום נוירובזלי	תרמו פישר סיינטיפיק	21103049	תווך בזאלי המיועד לתחזוקה והבשלה ארוכות טווח של אוכלוסיות תאים עצביים ללא צורך בשכבת הזנה אסטרוציטים
NutriStem-XF/FF	תעשיות ביולוגיות	05-100-1א	מדיום תרבות iPSC אנושי
PBS	סיגמא-אולדריץ'	D8662-500ML	מלח חיץ פוספט של Dulbecco, עם סידן, עם מגנזיום
PBS Ca2+/Mg2+ חינם	סיגמא-אולדריץ'	D8537-500ML	חיץ פוספט מלח של Dulbecco, עם סידן, עם מגנזיום
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	P4333-100ML	תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין המשמשת למניעת זיהום תרבית תאים מחיידקים.
פולי-אורניתין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4957	מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
SU5402	סיגמא-אולדריץ'	SML0443-5 מ"ג	מעכב סלקטיבי של קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 2 (VEGFR-2)
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T8787	4-(1,1,3,3-טטרמתילבוטיל)פניל- פוליאתילן גליקול, t- אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול, פוליאתילן גליקול טרט- אתר אוקטילפניל. משמש לחדירת תאים במבחני אימונוסטיין
Y-27632 (מעכב סלעים)	אנצו מדעי החיים	ALX-270-333-M005	מעכב סלקטיבי חדיר לתאים של חלבון קינאז (ROCK) המכיל סליל מסוג Rho. מגביר את הישרדות iPSC
μ-שקופית 8 באר	איבידי	80826	תמיכה באנליזה מיקרוסקופית מתקדמת של תאים קבועים