יצירת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של פיברובלסטים ונוירונים בקרנית האדם

תקציר

מקור: Sharif, R., et al. הנדסת רקמות הקרנית: מודל חוץ גופי של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת מערכת מודל תלת-ממדית של תרבית משותפת של פיברובלסטים ראשוניים בקרנית האנושית ותאים עצביים ממוינים. מערכת תרבית משותפת זו יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סטרומה-עצב.

פרוטוקול

1. HCFs ראשוניים (פיברובלסטים של הקרנית האנושית) תרבית ומבנים תלת ממדיים הרכבה

1. להרכיב מבנים תלת-ממדיים מצמחים שגודלו בעבר ב-EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית, לעבור ולספור HCFs.
2. זרעו בערך 1 x 10⁶ תאים/באר של HCF ראשוניים על תוספות קרום פוליקרבונט עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר מהמבנים התלת-ממדיים, יחד עם 1.5 מ"ל של EMEM טרי 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית לחלק העליון של המבנה. הוסף עוד 1.5 מ"ל של אותה מדיה לתחתית כל מבנה.
3. לאחר 24 שעות של זריעת תאים, תרבית את התאים עם EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה / Antimycotic, מגורה עם 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C) על ידי הוספת 1.5 מ"ל בחלק העליון ו 1.5 מ"ל בחלק התחתון של כל מבנה.
4. לשמור על התרביות באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 3 שבועות ולספק מדיה טרייה כל יומיים במהלך כל תקופת המחקר. אין צורך במעבר נוסף.

2. התמיינות תאים ותרביות משותפות

1. לאחר 3 שבועות, הוסף 8 x 10³ תאים / באר של תאי נוירובלסטומה אנושיים SH-SY5Y בחלק העליון של מבנים תלת ממדיים שהורכבו בעבר המכילים 1.5 מ"ל של EMEM המכיל 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטי, ו 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C).
   1. אפשרו לתאי הנוירובלסטומה SH-SY5Y לגדול על גבי תאי הסטרומה של הקרנית במשך 24 שעות לפחות לפני תחילת התמיינות התא.
2. התחל התמיינות תאי SH-SY5Y על ידי גירוי התאים עם EMEM המכיל 1% FBS ו 1.5 מ"ל של 10 מיקרומטר חומצה רטינואית על גבי המבנה. הוסף 1.5 מ"ל של EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטי 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C) לתחתית המבנה. שימו לב ששלב החומצה הרטינואית צריך להתבצע בחושך.
   1. המשך לתרבית התאים באמצעי התמיינות זה במשך 5 ימים.
3. כאשר התאים מגיעים לשלב ההתמיינות, העבר את התאים ל -1.5 מ"ל של מדיה נטולת סרום המכילה 2 ננומטר של גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) ו -1% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטית שנוספו ל- EMEM, על ידי הוספה לחלק העליון של המבנה. הוסף 1.5 מ"ל של EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטי 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C) לתחתית המבנה. שים לב כי שלב BDNF צריך להתבצע בחושך.
4. תרבית את התאים במשך 2 ימים נוספים לפני עיבוד לכל ניתוח נוסף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסה חוצצת פוספט של Dulbecco (1X)	Gibco מבית Life Technologies	14190-144
מלקחיים סטריליים	פישר סיינטיפיק	13-812-42	פישרברנד מנתח מלקחיים מחודדים במיוחד
סכיני גילוח בעלי קצה יחיד	פרסונה	270100
להבי אזמל כירורגיים סטריליים מס '10	להב כירורגי נוצה	2976#10
המדיום המינימלי החיוני של הנשר	ATCC	30-2003
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגיה	S11550	10% FBS נדרש להכנת מדיה
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X)	Gibco מבית Life Technologies	15240-062	1% אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית נדרשת להכנת מדיה
0.05% טריפסין EDTA (1X)	Gibco מבית Life Technologies	25300062
תוספות קרום פוליקרבונט עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר	קורנינג קוסטאר	3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-חומצה אסקורבית (ויטמין C)	סיגמא-אולדריץ'	SMB00390-14	ריכוז של 0.5 mM צריך לשמש למחקר
תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
חומצה רטינואית	סיגמא-אולדריץ'	SRP3014-10 מ"ג	להשתמש בריכוז סופי של 10uM
BDNF	סיגמא-אולדריץ'	₪2625-100 מ"ג	להשתמש בריכוז סופי של 2nM
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	VWR-אלפא Aesar	67-68-5	DMSO סטרילי ברמה טהורה במיוחד לשימוש
תרבית תאי Nunc תרמו-מדעית מטופלת EasYFlasks (T25)	פישר סיינטיפיק	12-565-351
תרבית תאי Nunc תרמו-מדעית מטופלת EasYFlasks (T75)	פישר סיינטיפיק	12-565-349

יש יש