Tissue Immunostaining for Imaging Mass Cytometry

תקציר

הסרטון מתאר הכנת דגימת רקמה להדמיית ציטומטריית מסה. הרקמה מעובדת תחילה כדי לחשוף את אפיטופי האנטיגן, לחדור לתאים ולחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים. לאחר מכן, הרקמה מודגרת עם קוקטייל נוגדנים מצומד מתכת וכתם גרעיני. לבסוף, דגימת הרקמה המטופלת מצולמת באמצעות סורק אופטי.

פרוטוקול

1. טיפול מקדים ברקמות:

לרקמות קפואות טריות:

1. הכניסו צנצנת קופלין מזכוכית למקפיא בטמפרטורה- 20°C לפחות שעה לפני השימוש.
2. הוציאו את המגלשות מהמקפיא ב-80°C והכניסו אותן לצנצנת זכוכית Coplin במקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך 15 דקות לפחות.
3. מתחת למכסה המנוע, השתמשו בחותך אמפולה כדי לפתוח את אמפולת הזכוכית 16% פרפורמלדהיד (PFA). השליכו את הזכוכית השבורה כראוי.
4. הוסיפו 10 מ"ל של 16% PFA ו-30 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS) לצנצנת קופלין מפלסטיק. ודא שה-PBS מקורר מראש ל-4°C.
5. העבירו תמיסה זו למקרר בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות לפחות.
6. לאחר 15 דקות, העבירו את צנצנת קופלין עם המגלשות למקרר 4°C למשך 10 דקות.
7. מעבירים את המגלשות מצנצנת הזכוכית לצנצנת קופלין מפלסטיק המכילה תמיסת 4% PFA קרה.
8. תקנו את המגלשות עם 4% PFA למשך 30 דקות בתוך המקרר.
9. שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-PBS בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כל אחת, והקפידו על שטיפה יסודית בין המחזורים.

עבור רקמות FFPE:

1. התחל עם קטעי רקמה משובצים פרפין קבוע פורמלין 5 מיקרומטר (FFPE) המותקנים על שקופיות המיקרוסקופ הסטנדרטי הטעון חיובית.
2. יש לחמם את המגלשות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה.
3. מוציאים את המגלשות ומקררים אותן לטמפרטורת החדר למשך כ-5 דקות.
4. הניחו את המגלשות בדיוור שקופיות ושטפו אותן באמבט קסילן במשך 3 דקות, פעמיים.
5. שוב, לשטוף את שקופיות עם 100% אתנול במשך 1 דקה, פעמיים.
6. באופן דומה, שטפו את המגלשות באתנול 95% ו-70% במשך דקה כל אחת.
7. לבסוף, יש לשטוף סופית פעמיים במים מזוקקים למשך 3 דקות.
   הערה: ההיפריון אינו יכול להתנפח בטווח של 2 מ"מ מקצה המגלשה, מרכז הרקמה ככל האפשר.

2. אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER)

1. הכינו מאגר Tris-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH9:
   1. מאגר Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER נרכש ב-100x ומדולל עד 1x למים בעלי ביצועים גבוהים של כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC).
   2. לדוגמה: 2.5 מ"ל Abcam ab93684 לתוך 247.5 מ"ל HPLC מים.
      הערה: אין להשתמש במאגר שגילו עולה על שישה חודשים.
2. הגדירו תא הסוואה לחימום המגלשות. ראשית, למלא את החלק התחתון של החדר עם 500 מ"ל של מי ברז. לאחר מכן, הוסף 250 מ"ל מי ברז לשני המיכלים הצדדיים ומי ברז 200 מ"ל למיכל המרכזי.
3. מקם עד 3 שקופיות בדיוור של 5 שקופיות.
4. מלא את דיוור השקופיות במאגר HIER עד שהרקמה תשקע לחלוטין. הערה: ודא שלדיוור השקופיות יש חור קטן בחלק העליון כדי לאוורר אדים ולמנוע לחץ.
5. הפעל את "תוכנית 4" במשך 20 דקות ב 95 ° C.
6. בינתיים, חממו מראש את תאי הדגירה לשלבים הבאים (ראו שלב 3.5)
7. לאחר הדגירה, הוציאו את הדיוור והניחו אותו בגיגית עם מים קרים מהברז.
8. תנו לו להתקרר במשך 5 דקות.
9. מוציאים חצי מהחיץ מהדיוור ומחליפים אותו במים מזוקקים. תנו לו להתקרר במשך 5 דקות.
10. הסירו בהדרגה את החיץ והגדילו את נפח המים פעמיים, כל אחת עם תקופת קירור של 5 דקות.
11. לבסוף, שטפו את המגלשות ב-100% מים מזוקקים.

3. חסימת האיגוד הלא ספציפי

1. הכינו מאגר חוסם (Tris-buffered מלוחים או TBS, 0.1% Triton X-100, 3% אלבומין בסרום בקר או BSA) על ידי הוספת 150uL של TBS עם 10% BSA ל-350uL של TBS עם 0.1% Triton X-10.
   הערה: TBS עם 10% BSA מאוחסן בטמפרטורה של -20°C ויש להפשיר אותו טרי בכל פעם.
2. בעזרת דיוור שקופיות או צנצנות קופלין, שטפו שקופיות במשך 5 דקות ב-TBS, 0.1% טריטון X-100 פעמיים.
3. הסר את השקופית מהדיוור והשתמש במגבון קים כדי להסיר כל מאגר מחוץ למעגל ה- PAP. אפשר ~ 1 דקה להתייבש מעט.
4. באמצעות P200, הוסף כמה טיפות של החיץ החוסם מעל הרקמה, בדיוק מספיק כדי לכסות אותה. קו PAP צריך לשמור על הנוזל מעל הרקמה.
   הערה: אם החיץ אינו מוגבל במעגל ה-PAP, צייר מחדש את מעגל ה-PAP סביב הרקמה כדי למנוע אובדן נוגדנים מאוחר יותר.
5. יש לדגור על המגלשה בטמפרטורת החדר בתא לחות למשך שעה. < בר/> הערה: קופסת טיפים פיפטה ריקה מתאימה לתא לחות. ודאו שיש כמות קטנה של מי ברז בתחתית.

4. צביעה בנוגדנים מצומדים ממתכת

1. הסר את הנוגדנים המצומדים ממתכת מ-4°C ואת הצנטריפוגה ב-10,000 x G למשך דקה אחת.
2. הכנת דילול אופטימלי של תערובת מאסטר נוגדנים בתערובת TBS, 0.1% Triton X-100 ו-1% BSA.
   הערה: א) דילול אופטימלי של כל נוגדן חייב להיקבע באופן ניסויי והוא אחד השלבים הקריטיים ביותר לניסויי ציטומטריה מוצלחים של מסות הדמיה. השתמש בגיליון אלקטרוני של Excel כדי לחשב אמצעי אחסון. לעשות רק מעט יותר מהנדרש בשל עלות נוגדנים. לדוגמה, אם זה לקח 200 uL של מאגר חסימה, לעשות 250uL מאסטר מיקס. ב) תערובת האב צריכה להיות מוכנה טרייה לכל ניסוי במהלך שלב החסימה.
3. לאחר הדגירה (עיין בשלב 3.5), הסר את השקופית מהאינקובטור.
4. הסר את מאגר החסימה העודף על ידי הקשה אנכית ואופקית על מגבוני Kim. פעולה זו אמורה להשאיר חיץ חוסם כלשהו על הרקמה, אך תסיר את רובו.
5. אפשר ~ 1 דקה להתייבש מעט.
6. הניחו את המגלשה בתא הלחות בטמפרטורה של 4°C ואפשרו לה להתאזן.
7. לאחר מכן, בזהירות פיפטה תערובת נוגדנים מאסטר על הרקמה, זהיר מאוד כי הפתרון הוא הכיל בתוך מעגל PAP.
8. סגרו את תא הלחות ודגרו למשך הלילה ב-4°C.
9. לאחר הדגירה בלילה, הסירו את המגלשה מ-4°C והסירו את עודפי תערובת המאסטר על ידי הקשה אנכית ואופקית על מגבוני Kim.
10. הניחו את השקופית במיילר או בצנצנת קופלין; שטפו במשך 5 דקות במי מלח חוצצים פוספט או PBS, בתוספת 0.2% Triton X-100, פעמיים.
11. לאחר מכן, שטפו את המגלשה ב- PBS במשך 5 דקות, פעמיים. הסר את המגלשה ואפשר לה להתייבש במשך כדקה.

5. אינטרקלציה של DNA

1. עבור אינטרקלציה של DNA, לדלל את Intercalator-IR 1:1000 ב- PBS.
2. בזהירות pipete intercalator מדולל על הרקמה, להיות זהיר מאוד כי הפתרון הוא הכיל בתוך מעגל PAP.
3. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות המשמש לחסימה.
4. לאחר מכן, הקש על השקופיות אנכית ואופקית על מגבוני קים כדי להסיר צבע Intercalator-Ir עודף.
5. הניחו את המגלשה בצנצנת הדיוור או קופלין ושטפו פעמיים במי HPLC במשך 5 דקות כל אחת.
6. יבשו את המגלשות במייבש במשך 5 דקות לפני הסריקה.

6. סריקת תמונות

1. לסריקת שקופיות, השתמש בחריטה של זכוכית קצה קרביד כדי לגרד ארבעה סימני X קלושים לתוך השקופית. נקודות הוראה מדויקות יאפשרו את רישום התמונה הטוב ביותר.
   הערה: אל תתקרבו יותר מדי לקצה.
2. סרוק באמצעות סורק מסמכים שטוח במהירות של לא פחות מ- 1200 נקודות לאינץ'
3. חתוך תמונה זו קרוב ככל האפשר לגבולות השקופית ושמור אותה בכונן הבזק.
4. לרישום משותף של תמונה, סרוק את השקופית ב- Hamamatsu NanoZoomer עם הכיתוב "Pre_IMC" בשם הקובץ.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של הליך אימונוסטיין רקמות להדמיית ציטומטריית מסה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד
צנצנות קופלין
דיוור פלסטיק 5 שקופיות עם חור אוורור
מכשיר אחזור אנטיגן (תא הסוואה)
סורק
כימיקלים ואנזימים:
קסילן
אתנול 200 הוכחה
HPLC מים
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer
טב"ס
TBS עם 0.1% Trition X-100
TBS עם 10% BSA
PBS
PBS עם 0.2% Trition X-100