$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת פרוסות
- לבנות או להשיג תא שחזור פרוסה.
הערה: העיקרון עבור תא התאוששות הוא פשוט וניתן ליצור אותו במעבדה (איור 1). בקצרה, החדר הוא כלי קיבול שבו סל מוכנס להחזיק את פרוסות המוח ברמה נמוכה יותר מפני השטח של נוזל מוחי מלאכותי (aCSF).
- לדוגמה, קבלו ארבע טבעות (בגובה 4-6 מ"מ) (איור 1A, מבט מהצד; B, מבט מלמעלה) על ידי חיתוך מזרק 30 סמ"ק. לאחר מכן, הדביקו רשתות (למשל, נחתכו מצינור ניילון) לצד אחד של הטבעות כדי להחזיק את פרוסות המוח (איור 1B) ולהדביק את הטבעות יחד.
הערה: ניתן להשתמש באקדח דבק.
- לאחר שארבע הטבעות מודבקות, הדביקו קיר פלסטיק מעוקל בצורת טרפז איזוצלות לשתיים מהטבעות (איור 1A ו-B) כדי להסיט בועות חמצן מפרוסות המוח המתאוששות (איור 1C ו-D). כפי שניתן לראות באיור 1D, הכניסו מערכת פיזור חמצן (כאן, צינור פיזור גז) באותו צד של דפנות הפלסטיק.
- לפני החיתוך, יש לחמצן (95% O2/5% CO2) ולקרר את תמיסת החיתוך (ראה שלב 1.4) ל-0 - 2°C.
- מלא את תא השחזור המותאם אישית ב- aCSF סטנדרטי בטמפרטורת החדר (RT). ודא כי aCSF מחומצן היטב (20 - 30 דקות, הזמן עשוי להשתנות בהתאם לנפח התא) לפני הנחת פרוסות בתא ההתאוששות. ודאו שבועות גז אינן באות במגע ישיר עם הפרוסות או משבשות אותן.
- מרפדים את מגש הקרח הוויברטומי בקרח וממלאים אותו במים קרים, כך ששליש עד מחצית מתא החיתוך שקוע. הניחו בזהירות מערכת אספקת חמצן (למשל, אבן מפזרת גז) ובדיקת טמפרטורה בתא החיתוך, כך שאף פריט לא יפריע לתנועת הלהב או למניפולציה של הפרוסה.
- הכינו את אזור הדיסקציה ואת הכלים הדרושים לחילוץ המוח ולניתוח אזור המוח הרצוי.
הערה: הדיסקציה המדויקת שתבוצע תהיה תלויה באזור המוח הספציפי שנחקר מכיוון שמבני מוח שונים ידרשו חיתוך במישורים שונים (למשל, פרוסות קורונליות, קשת או אופקיות).
- הניחו את הכלים הבאים על כרית תחתונה: מספריים לעריפת ראשים, אזמל, מספריים קטנים ישרים וחדים, מלקחיים לשימורי כלי דם (או כל כלי כירורגי בעל קצה רחב, כגון רונגורים, המתאים יותר לגולגולות חולדות), מלקחיים המוסטטיים מעוקלים, פינצטה, מרית, מרית גריפה, נייר פילטר, צלחת פטרי, סכין גילוח בעלת קצה יחיד ודבק ציאנואקרילט.
- כשהטמפרטורה מגיעה ל-0-2°C, העבירו את תמיסת החיתוך לתא החיתוך (מגש חיץ).
- מרדימים את העכבר בתא ייבוש באמצעות isoflurane. הכמות המדויקת עשויה להשתנות בהתאם לגודל התא בו משתמשים, אך עבור כלוב קופסת נעליים קטן, השתמש בכמה טיפות (~ 3-4). השאירו את העכבר בכלוב עד שיהפוך ללא תנועה (לא יגיב לגירויי מישוש; בסביבות 15 שניות בתנאים המתוארים כאן). בצע בדיקות צביטת זנב ורגל כדי להבטיח שבעל החיים מורדם עמוק, ולאחר מכן ערוף את ראשו לפני שהלב מפסיק לפעום (משפר את יכולת הקיום של התא).
הערה: עם הצדקה מתאימה, מעבדות מסוימות מקבלות את האישור לבצע עריפת ראש חיה על מנת למזער ככל האפשר תהליכים אקסיטוטוקסיים ולשפר את יכולת הקיום של התא.
- בצע את הדיסקציה.
הערה: יש לחלץ את המוח במהירות (<45 שניות).
- בעזרת האזמל חותכים את העור השטחי על גבי הגולגולת מרוסטרל לקאודל.
- מקלפים את הקרקפת בכל צד של הראש.
- בעזרת מספריים קטנים ישרים וחדים, חותכים את הצלחת הבין-קודקודית לאורך התפר הלמבואיד כדי להסיר את המוח הקטן. הסר את עצם העורף.
- באמצעות אותם מספריים, לחתוך את התפר sagittal.
- החליקו את מלקחיים קנולציית כלי הדם (או רונגורים אם שברו גולגולת חולדה) מתחת לכל עצם קודקודית ומשכו כדי לחשוף את המוח.
- בעזרת המלקחיים ההמוסטטיים המעוקלים, צבטו את העצמות הקדמיות כדי לשבור אותן, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה או במלקחיים כדי להסיר את העצמות השבורות. חותכים ומסירים את הדורה מאטר בעדינות ככל האפשר, מכיוון שהיא עלולה להפריע לדיסקציה.
- החליקו את המרית מתחת למוח ומשכו אותה בעדינות אל מחוץ לגולגולת. הניחו אותו בתא החיתוך (מגש חיץ) שהיה מלא בעבר ב-aCSF קר כקרח. תנו למוח להתקרר למשך 1-2 דקות.
- הכינו את משטח הדיסקציה על ידי מילוי צלחת פטרי בקרח ומעט מי קרח כדי לאפשר מגע גדול יותר עם פני השטח. מכסים את הכלי במכסה ומניחים עליו נייר פילטר. הרטיבו את נייר הסינון עם aCSF קר.
- לאחר שהמוח מתקרר, הניחו את המוח על צלחת הפטרי המלאה בקרח ובצעו במהירות את הדיסקציה המתאימה כדי להשיג את מישור החיתוך הרצוי.
- כדי להשיג פרוסות קשת המכילות את גרעין האקומבנס (NAc), השתמש בסכין גילוח בעל קצה יחיד כדי לחתוך ולהסיר את פקעות הריח ואת המוח הקטן אם הם עדיין קיימים. לאחר מכן, בצע חתך סגיטלי של 2-3 מ"מ מהגבול הצידי של ההמיספרה הימנית כדי לקבל את המשטח השטוח שיודבק על לוח החזקת הדגימה (ראה שלב 1.8.11).
הערה: חיתוך רק 2 - 3 מ"מ מהגבול הרוחבי של חצי הכדור יאפשר איסוף של פרוסות המכילות NAc משני חצאי הכדור. הדיסקציה המתאימה תהיה תלויה באזור המוח הנחקר. כאן, הדיסקציה מבוצעת כך שתאי עצב NAc יכולים להירשם בפרוסות מוח קשת.
- דבק במהירות (באמצעות דבק ציאנואקרילט המודבק על צלחת החזקת הדגימה) את משטח החיתוך השטוח של המוח על הצלחת בהתאם למישור החיתוך הרצוי. כדי להשיג פרוסות מוח sagittal ראה שלב 1.8.10.
- הניחו מיד את צלחת האחיזה של הדגימה בתא החיתוך כך שהמוח ייחתך באופן רוסטרו-קאודי (לבטיחות, הגדירו את מחזיק הלהב רק כאשר צלחת הדגימה מאובטחת).
- הגדר את הוויברטום עם פרמטרי חיתוך מתאימים (פרמטרים המשמשים במעבדה לוויברטומה המוזכרים בחומרים: מהירות 3 - 4, רטט 9-10 ועובי פרוסה 250 מיקרומטר).
- לאחר החיתוך, השתמשו בפיפטת העברה גזורה מפלסטיק כדי להעביר את פרוסות המוח לתא ההתאוששות (ב-RT) (ראו שלב 1.3). זמן ההחלמה עשוי להשתנות בהתאם לסוג העצבי הנחקר (בדרך כלל 30 - 90 דקות).
2. הקלטת מיקרופיפטות והכנת אסדות
- עיין בהנחיות הספציפיות של המדריך למשתמש של המושך כדי להשיג את מאפייני המיקרופיפטה הרצויים.
הערה: עבור MSNs, אנו משתמשים בטווח התנגדות פיפטה של 3.2-4.0 MΩ.
- חמצן את aCSF ולהתאים את הזרימה ל 2 מ"ל / דקה. לשאוב aCSF באמצעות משאבה פריסטלטית או קווי ואקום המותקנים במתקן.
- הפעל את בקר מחמם הזילוח וכוונן את הגדרות הטמפרטורה על מנת להשיג את הטמפרטורה הרצויה (למשל, 31.8-32.2 מעלות צלזיוס).
הערה: יציבות הטמפרטורה תלויה בכך שיש גם רמת aCSF קבועה וגם מהירות זרימה קבועה בתא. מאחר שמספר תכונות ביופיזיקליות של תאי עצב (למשל, עמידות קלט, Ri, המכונה גם עמידות לממברנה, Rm) רגישות לטמפרטורה, חשוב לשמור על טמפרטורה יציבה.
- הפעל את המגבר, המצלמה, המיקרומניפולטור ותאורת הרקע של המיקרוסקופ הנשלטים על ידי מחשב. אם אתם מבצעים ניסוי הדורש גירוי חשמלי של הרקמה, הפעילו את בקר הגירוי ואת יחידת הבידוד.
הערה: חלק מהמגברים של יצרנים אחרים ממליצים על "חימום" לפני השימוש, ולכן מומלץ לעיין במדריך לקבלת הליך ההפעלה המדויק.
- הפעל לכידת מצלמה, רכישת אותות ותוכנת מגבר.
- מיקום פרוסה ותצוגה חזותית:
- בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק קצוצה, משכו בעדינות פרוסת מוח אחת מתא ההתאוששות.
- מניחים את פיפטת ההעברה בתא ההקלטה וסוחטים בעדינות את הפרוסה מהפיפטה אל המכסה המצפה את תחתית החדר.
הערה: כל עוד לא מתרחשת הצפה, זה לא מזיק שיש קצת aCSF מתא ההתאוששות נשפך לתוך האמבטיה.
- השתמשו במלקחיים כדי לשנות את מיקום הפרוסה כך שהאזור הרצוי ימוקם בדיוק במרכז תא ההקלטה. השתמש במיקרוסקופ, עדשת האובייקט בעוצמה נמוכה (4X) והעינית לסיוע במיקום.
- לאחר שהושגה התנוחה הרצויה, אבטחו את תנוחת פרוסת המוח באמצעות החזקת פרוסה (המכונה גם "נבל") בחדר.
- עברו לעדשה אובייקטיבית בהספק גבוה (40X) והורידו אותה בעדינות עד שנוצר מגע עם ה-aCSF בתא.
- השתמש בגלגל הכוונון העדין כדי להביא את הרקמה למיקוד. בעת מגע עם aCSF, אין להשתמש בגלגל הכוונון הגס במיקרוסקופ מכיוון שהנמכת עדשת המטרה יתר על המידה יכולה למחוץ את הפרוסה או אפילו לשבור את החלקת הכיסוי המצפה את תחתית החדר, מה שעלול לגרום ל- aCSF להישפך על המעבה ולפגוע בו.
- כאשר המוקד הוא ברמת הרקמה, התבונן בתאים באזור היעד לקבלת צורה. תאים מתים ניתנים לזיהוי בקלות על-ידי קרום הפלזמה והגרעין המנופחים שלהם (איור 1E). תאים בריאים צריכים להופיע כמבנים הומוגניים עגולים, נמנעים או אליפטיים (איור 1E).
- חפש תא יעד. סמן אותו על מסך המחשב כדי לעזור להנחות את מיקרופיפטה ההקלטה. אם אתה משתמש בתוכנה כגון QCapture, צייר ריבוע סביב תא היעד על ידי לחיצה ממושכת על העכבר השמאלי.
- הרם את עדשת האובייקט כך שיהיה מספיק מקום בקונוס שנוצר על ידי עדשת האובייקט להיות במגע עם aCSF כדי למקם ולהזיז את micropipette הקלטה.
- מיקום ומיקום מיקרופיפטה
- באמצעות מזרק 1 מ"ל, מחט מיקרומזרק אל-מתכתית ומסנן ייעודי, ממלאים מיקרופיפטה בתמיסה פנימית שהוכנה מראש בהתאם לניסוי המתוכנן (תמיסה פנימית מבוססת K+ או Cs+, ראו חומרים להרכב). השתמש בתמיסה מספקת כדי שהפתרון הפנימי יבוא במגע עם אלקטרודת חוט הכסף המצופה כלוריד בתוך מחזיק המיקרופיפטה.
הערה: ניתן לכלור את אלקטרודת חוט הכסף על ידי השרייתה באקונומיקה ביתית. ניתן להוסיף טריפוספטים נוקלאוזידים (אדנוזין טריפוספט, ATP וגואנוזין טריפוספט, GTP) לתמיסה הפנימית לפני השימוש. שמור את המזרק המכיל את התמיסה על קרח כדי למנוע התפרקות ATP/GTP.
- ודא שאין בועות אוויר במיקרופיפטה מכיוון שהן יכולות לצאת בזמן שהמיקרופיפטה נמצאת ברקמה ולטשטש את הפרוסה.
- הניחו את המיקרופיפטה במחזיק האלקטרודות כך שהתמיסה תבוא במגע עם אלקטרודת החוט המצופה בכלוריד כסף.
- הדקו את מכסה הפיפטה, כך שמכונת הכביסה של החרוט תיצור אטימה סביב המיקרופיפטה.
- הפעל לחץ חיובי לפני טבילת המיקרופיפטה ב- aCSF כדי למנוע כניסת פסולת לפיפטה.
- הניחו את במת הראש במצב נעול (מול התא), ובעזרת המיקרומניפולטור, כוונו אותה כלפי מטה לכיוון התא כך שהיא תהיה בערך מתחת למרכז המטרה השקועה.
- תוך כדי הזזת המיקרופיפטה עם המיקרומניפולטור (מוגדר במהירות בינונית עד גבוהה), השתמש במסך המחשב כדי לאתר את המיקרופיפטה ולהנחות אותה לעבר מיקום התא על ציר X-Y.
- מדוד את התנגדות המיקרופיפטה על ידי הפעלת שלב מתח (למשל, 4 mV עבור 100 מילישנייה), שניתן לבצע באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנה ספציפית כגון מצב 'אמבטיה' אם משתמשים ב"בדיקת ממברנה" בתוכנת Clampex (ראה גם שלב 4). על מנת לוודא שאין בועות אוויר או עצמים זרים אחרים חוסמים את המיקרופיפטה, יש להפעיל לחץ חיובי באמצעות מזרק מלא אוויר (למשל, מזרק 30 סמ"ק) המחובר למחזיק המיקרופיפטה באמצעות צינורות פוליאתילן.
- לאחר ניקוי המיקרופיפטה, בצע היסט מתח כדי להפחית את זרם הפיפטה לאפס, אשר ניתן לבצע באופן ידני או באמצעות תוכנה ספציפית כגון 'קיזוז פיפטה' על מפקד המגבר הנשלט על ידי מחשב.
הערה: פונקציה זו תפצה על כל מתח שנגרם על ידי הבדלי ריכוז בין האמבטיה לבין תמיסות המיקרופיפטה (כלומר, פוטנציאל צומת נוזלי).
3. בדיקת ממברנות
NOTE: שלב זה חל על המגבר המוזכר בחומרים.
- בעת שימוש במפקד מגבר נשלט מחשב, הגדר אותו תמיד למצב מהדק מתח כדי לבצע את בדיקת הממברנה.
הערה: כאשר בדיקת הממברנה מוגדרת במצב "אמבטיה", בדיקת הממברנה מאפשרת למדוד את התנגדות המיקרופיפטה ואת התנגדות האטם בעת יצירת האטם.
- לאחר קרע הממברנה (ראה שלב 4.8), העבר את בדיקת הממברנה למצב "תא" כך שניתן יהיה לקבל התנגדות סדרה (Rs) (המכונה גם התנגדות גישה, Ra), Ri וקיבול הממברנה (Cp).
4. גישה סופית, היווצרות חותם וקבלת תצורת התא כולו
- בעזרת גלגל המיקוד העדין התחילו להתמקד כלפי מטה תוך הנמכת המיקרופיפטה בהדרגה. תמיד התמקדו תחילה למטה ולאחר מכן הורידו את המיקרופיפטה מטה למישור המיקוד. זה יבטיח כי קצה micropipette לא לחדור בפתאומיות לתוך הפרוסה.
- כאשר המיקרופיפטה באה במגע עם פני השטח של הפרוסה, האט את מהירות המיקרומניפולטור למצב בינוני-נמוך.
- הפעילו בעדינות לחץ חיובי קל כשהמזרק מלא האוויר מחובר למחזיק הפיפטה, כדי לפנות לכלוך מנתיב הגישה.
- התקרב לתא לסירוגין עם ידיות הבקרה X-Y-Z, או על ידי התקרבות באלכסון (אם מודל המיקרומניפולטור מאפשר זאת) כאשר שני צירי X-Z משתנים עם סיבוב ידית ציר Z. השיטה השנייה תמנע דחיסה אנכית של רקמות.
הערה: כאן, המטרה היא להתקרב לתא על ידי גרימת נזק מינימלי לפרוסה. כאשר המיקרופיפטה קרובה מספיק לתא מופיעה גומה (שינוי צבע עגול של פני התא שנגרם על-ידי הלחץ החיובי המופעל דרך קצה המיקרופיפטה) (איור 2).
- כאשר הגומה מופיעה (איור 2-1), הפעילו יניקה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר לצינור היניקה של מחזיק הפיפטה, כדי ליצור את האטם (איור 2-2). המשך לעקוב אחר בדיקת הממברנה.
הערה: אם נוצר חותם חלקי (<1 GΩ), הזרקת זרמים שליליים על ידי הורדת פוטנציאל האחיזה (על מפקד המגבר הנשלט על ידי מחשב) יכולה להקל על היווצרות האטם ולהגיע להתנגדות של ג'יגה-אוהם ("חותם ג'יגה-אוהם" או "ג'יגאזל" >1 - 5 GΩ). ההתנגדות הגבוהה של האטם (>1 GΩ) תגביל את זיהום הרעש לאות המוקלט ותתרום ליציבות המכנית של המדבקה.
- בזמן היווצרות ג'יגאזל, השתמש במפקד המגבר הנשלט על ידי מחשב כדי להביא את פוטנציאל האחיזה של התא קרוב ככל האפשר לפוטנציאל מנוחה פיזיולוגי (Vrest) על מנת למנוע שינויים פתאומיים ברגע שהקרום נקרע. לדוגמה, MSN הם בדרך כלל מהודקת מתח ב -70 או -80 mV (מנוחה V פיזיולוגית: -70 עד -90 mV).
- לאחר היווצרות הג'יגאזל, פצה על קיבוליות מהירה ואיטית באופן ידני או אוטומטי. אם אתה משתמש במפקד מגבר נשלט מחשב כגון Multiclamp commander, לחץ על 'Auto' עבור 'Cp Fast' ו- 'Cp Slow'.
- אם האטם נשאר יציב ומעל 1 GΩ (או מזריק פחות מ-10-20 pA כדי להחזיק את התא בפוטנציאל הממברנה הרצוי), יש להפעיל יניקה קצרה וחזקה דרך אותו צינור כמו ב-4.5 כדי לקרוע את קרום הפלזמה (איור 2-3).
הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר גירסאות ניסיון. קרע טוב בקרום מושג כאשר היניקה מבוצעת חזק מספיק כך שהקרום הקרוע אינו סותם את המיקרופיפטה (מה שעלול להוביל לעלייה ב- Rs במהלך ההקלטה), אך חלש מספיק כדי לא למשוך חלק גדול מהממברנה או התא.
- לאחר השגת תצורה מוצלחת של תאים שלמים, עקוב באופן קבוע אחר מיקום המיקרופיפטה כדי להעריך ולתקן סחף משמעותי מכיוון שהוא עלול להוביל לאובדן המדבקה. משרעת הסחף עשויה להשתנות בהתאם למספר גורמים, למשל, איכות התקנת האסדה וכוחות המשיכה על במת הראש. באופן אידיאלי, סחף צריך להיות כמעט לא קיים.
- על ידי מעבר למצב "תא" בבדיקת הממברנה, הצג פרמטרים שונים של התא כגון Ri, Rs ו- Cp. עקוב אחר פרמטרים אלה במהלך ההקלטה.
הערה: כל הפרמטרים הללו יכולים לסייע בהערכת מצב הבריאות הראשוני של התאים וסוגי התאים (ראה סעיף "בדיקת ממברנה", שלב 4).
