$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הבחנה של hiPSCs חיוביים rtTA/Ngn2 לנוירונים על גבי 6-well MEAs ו-Glass Coverslips
הערה: בפרוטוקול זה, הפרטים מסופקים עבור הבחנה בין transactivator מבוקר טטרציקלין הפוך (rtTA) / Neurogenin-2 (Ngn2)-חיובי hiPSCs על 6-well MEAs (התקנים המורכבים מ 6 בארות עצמאיות עם 9 הקלטה 1 מיקרואלקטרודות משובצות ייחוס לכל באר).
- הכינו את MEAs (יום 0 ויום 1)
- יום לפני תחילת הבידול, יש לעקר את ה-MEAs בהתאם להמלצת היצרן.
- לדלל את חלבון ההדבקה Poly-L-Ornithine (אש"ף) במים סטריליים אולטרה-טהורים לריכוז סופי 50 מיקרוגרם/מ"ל. צפו את אזור האלקטרודות הפעילות של 6 בארות MEAs על ידי הנחת טיפה של 100 μL של אש"ף מדולל בכל באר.
- לדגור את 6-בארות MEAs לילה (O/N) באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2. למחרת, שאפו אש"ף המדולל. שטפו את משטחי הזכוכית של 6 בארות MEAs פעמיים עם מים סטריליים טהורים במיוחד.
- יש לדלל למינין בתערובת F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל. צפו מיד את אזור האלקטרודות הפעילות של 6 בארות MEAs על ידי הצבת טיפה של 100 μL בכל באר.
- לדגור את 6-בארות MEAs באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 במשך 2 שעות לפחות.
- צלחת hiPSCs (יום 1)
הערה: הכרכים המוזכרים בשלבים 1.2.1 - 1.2.4 מניחים כי hiPSCs חיוביים rtTA / Ngn2 מתורבתים בצלחת 6 בארות וכי התאים של באר אחת נקצרים. הנפחים הדרושים לציפוי התאים ב-MEAs של 6 בארות תלויים במספר ה-MEAs של 6 בארות המשמשים בניסוי; המספרים שצוינו בשלבים 1.2.6 - 1.2.8 מאפשרים שינוי קנה מידה לגדלי ניסוי שונים.
- DMEM/F12 חם, תמיסת ניתוק תאים (CDS) ומדיום E8 עם 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין ל-R/T. הוסף דוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל ומעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) למדיום E8.
- שאפו את המדיום המושקע של hiPSCs חיוביים rtTA / Ngn2 והוסיפו 1 מ"ל CDS ל- hiPSCs. דגירה 3 - 5 דקות באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2. בדקו תחת המיקרוסקופ אם התאים מתנתקים זה מזה.
- מוסיפים 2 מ"ל DMEM/F12 לבאר, מרחפים בעדינות את התאים עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר ומעבירים את התאים לצינור של 15 מ"ל. הוסף 7 מ"ל DMEM/F12 לתרחיף התא. סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- שואפים את הסופרנאטנט ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום E8 מוכן. נתק את hiPSCs על ידי הצבת קצה פיפטה של 1,000 μL בצד של צינור 15 מ"ל והשעיה מחדש של התאים בעדינות. בדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים מנותקים.
- קבע את מספר התאים (תאים/מ"ל) באמצעות תא המוציטומטר.
הערה: צלחת 6 בארות במפגש של 80 - 90% תניב בדרך כלל 3.0 - 4.0 x 106 תאים בסך הכל.
- שאפו את הלמינין המדולל. עבור MEAs 6-well, לדלל את התאים כדי לקבל תרחיף תאים של 7.5 x 105 תאים / מ"ל. לוחית את התאים על ידי הוספת טיפה של 100 μL של תרחיף התא על אזור האלקטרודה הפעילה בכל באר של 6-באר MEAs.
- מקם את 6 בארות MEAs באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2 במשך 2 שעות.
- לאחר שעתיים, הוסף בזהירות 500 μL של מדיום E8 מוכן לכל באר של 6-well MEAs. מקם את 6-well MEAs O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- שינוי המדיום (יום 2)
- למחרת, הכינו DMEM/F12 עם 1% (v/v) תוסף N-2, 1% (v/v) חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף נוירוטרופין-3 רקומביננטי אנושי (NT-3) לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, גורם נוירוטרופי רקומביננטי אנושי (BDNF) לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. מחממים את המדיום ל 37 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים למינין לריכוז סופי של 0.2 מק"ג/מ"ל למדיום. סנן את המדיום שנוצר. שאפו את המדיום המשומש מהבארות של 6 בארות MEAs ואת צלחת 24 בארות ולהחליף אותו עם המדיום מוכן. לדגור את 6-בארות MEAs O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- הוסף אסטרוציטים של חולדות (יום 3)
הערה: הכרכים המוזכרים בפרוטוקול זה מניחים שהאסטרוציטים של החולדות מתורבתים בצלוחיות תרבית T75. זה קריטי שהאסטרוציטים של החולדות שמתווספים לתרביות יהיו באיכות טובה. אנו משתמשים בשני קריטריונים כדי לבדוק אם אסטרוציטים של חולדות הם באיכות טובה. ראשית, תרבית האסטרוציטים של החולדות אמורה להיות מסוגלת לגדול באופן שוטף בתוך עשרה ימים לאחר הבידוד ממוחות העוברים של החולדה. שנית, לאחר פיצול תרבית האסטרוציטים של החולדות, אסטרוציטים של חולדות אמורים להיות מסוגלים ליצור חד-שכבה מתמזגת. אם תרבית אסטרוציטים של חולדות אינה עומדת בשני קריטריונים אלה, אנו ממליצים לא להשתמש בתרבית זו לניסויי התמיינות (differentiation).
- חם 0.05% טריפסין- אתילאנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) ל RT. לחמם את המלח חוצץ הפוספט של דולבקו (DPBS) ו- DMEM/F12 עם 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין ל 37 ° C.
- שאפו את המדיום המושקע של תרבית אסטרוציטים חולדה. שטפו את התרבית על ידי הוספת 5 מ"ל DPBS וסחפו אותה בעדינות.
- שאפו את DPBS והוסיפו 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA. מרחו את הטריפסין-EDTA סביב בעדינות. דגירה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 למשך 5 - 10 דקות.
- בדקו תחת המיקרוסקופ אם התאים מנותקים. נתק את התאים האחרונים על ידי פגיעה בבקבוק כמה פעמים.
- הוסף 5 מ"ל DMEM/F12 לצלוחית. Triturate את התאים בעדינות בתוך הבקבוק עם פיפטה 10 מ"ל. לאסוף את השעיית התא בצינור 15 מ"ל. סובב את הצינור ב 200 x גרם במשך 8 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM/F12. קבע את מספר התאים (תאים/מ"ל) באמצעות תא המוציטומטר.
- הוסף 7.5 x 104 אסטרוציטים לכל באר של 6 בארות MEAs. לדגור את MEAs O/N באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- שינוי המדיום (יום 4)
- הכינו מדיום נוירובזאלי עם תוסף B-27 (v/v), 1% (v/v) L-alanyl-L-גלוטמין ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף NT-3 לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, BDNF לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. בנוסף, להוסיף ציטוזין β-D-arabinofuranoside לריכוז של 2 μM.
הערה: ציטוזין β-D-arabinofuranoside מתווסף למדיום כדי לעכב התפשטות אסטרוציטים ולהרוג את שאר hiPSCs שאינם מתמיינים לנוירונים.
- סנן את המדיום וחם ל 37 ° C. שואפים את המדיום בילה מן הבארות של 6-בארות MEAs ולהחליף אותו עם המדיום מוכן. שמור על 6-well MEAs באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
- רענן את המדיום (יום 6 - 28)
הערה: החל מהיום השישי, רענן חצי מהמדיום כל יומיים. מהיום ה-10 ואילך מוסיפים למדיום סרום בקר עוברי (FBS) לתמיכה בכדאיות האסטרוציטים.
- הכינו מדיום נוירובזאלי עם תוסף B-27 (v/v), 1% (v/v) L-alanyl-L-גלוטמין ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין. הוסף NT-3 לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, BDNF לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, ודוקסיציקלין לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/מ"ל. מהיום העשירי ואילך, גם להשלים את המדיום עם 2.5% (v/v) FBS. סנן את המדיום וכתוצאה מכך חם ל 37 ° C.
- הסר מחצית המדיום המשומש מהבארות של 6 בארות MEAs באמצעות פיפטה 1000 μL והחלף אותו עם המדיום מוכן. שמור על 6-well MEAs באינקובטור לח 37 ° C עם אטמוספירה של 5% CO2.
2. קבע את הפרופיל הנוירופיזיולוגי של נוירונים שמקורם ב-hiPSC
הערה: שבועיים עד שלושה לאחר השראת ההתמיינות, תאי העצב שמקורם ב-hiPSC יכולים לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם. בחלק זה, דוגמאות של כמה ניתוחים במורד הזרם ניתנים שניתן לבצע כדי לקבוע את הפרופיל הנוירופיזיולוגי של נוירונים הנגזרים hiPSC.
- אפיון פעילות הרשת העצבית באמצעות MEAs
- תיעוד של 20 דקות של פעילות אלקטרופיזיולוגית של נוירונים שמקורם ב-hiPSC בתרבית ב-MEAs. במהלך ההקלטה, לשמור על הטמפרטורה על 37 ° C, ולמנוע אידוי ושינויים pH של התווך על ידי ניפוח זרימה קבועה ואיטית של גז לחות (5% CO2, 20% O2, 75% N2) לתוך MEA.
- לאחר הגברה של 1200X (MEA 1060, MCS), דגמו את האות במהירות של 10 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת הנתונים MCS. נתח את הנתונים (זיהוי ספייק ופרץ) באמצעות חבילת תוכנה מותאמת אישית.