$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת הפתרונות
- נוזל מוחי מלאכותי סטנדרטי (ACSF; טבלה 1)
- השתמשו במלחים בעלי טוהר גבוה ובכוסות זכוכית נקיות שנשטפו בעבר במים מזוקקים פעמיים כדי להכין תמיסה טרייה. השתמש במים מזוקקים כפולים באיכות גבוהה להכנת כל התמיסות האקסטרה ותוך תאיות.
- לפי טבלה 1, קחו 2 ליטר כדי להמיס את NaHCO3 במים של 500 מ"ל וכוס אחרת כדי להמיס את המלחים האחרים כדי למנוע משקעים של יונים דו-ערכיים. נקו את המרית באופן שיטתי במים מזוקקים פעמיים וייבשו אותה לפני נטילת מלח. השתמשו במערבל מגנטי כדי ליצור הומוגניות של המסה. הוסיפו את התמיסות משני הכוסות לבקבוק נפחי מתאים והביאו אותן לנפח המתאים.
- ודא כי הפתרון החוץ תאי הסופי הוא שקוף לחלוטין וללא כל זכר של משקעים.
- יש למרוח תערובת גז המורכבת מ-95% O2 ו-5%CO2 (גז קרבוגן) עם נר מיקרו-פילטר זכוכית (Ø 13 מ"מ) 20 - 30 דקות לפני ערבוב הפרוסות. שלוט בזהירות באוסמולריות (2 - 3 מדידות רצופות) של ACSF עם אוסמומטר (טווח אופטימלי: 314 - 325 mOsmol / L). אחסנו את התמיסה הנותרת לאחר ההכנה בטמפרטורה של 4°C והשתמשו בה תוך 3 ימים.
- פתרון חיתוך (סוכרוז-ACSF; טבלה 2)
- הכינו 3 ליטר של תמיסה טרייה. השתמש 1 L כדי להכין פרוסות מוח מחיה אחת. אחסנו את התמיסה הנותרת בטמפרטורה של 4°C והשתמשו בה תוך 3 ימים.
הערה: ריכוזים גבוהים של Mg2+ ו-Ca2+ נמוכים משמשים להפחתת ההולכה הסינפטית, וחלק מה-NaCl מוחלף בסוכרוז כדי לשמר את הרקמה.
- פתרונות תוך תאיים
- הכינו מראש פתרון של 100 מ"ל עבור הקלטות כפולות של תאים שלמים (טבלה 3).
- כלול methylsulfate כדי להשיג התאוששות טובה של מורפולוגיה התא. הוסף ביוציטין (0.1 - 0.4%) כדי לבחון את המורפולוגיה של תא העצב לאחר מכן. כלול צבע פלואורסצנטי (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 41) כדי לעקוב אחר הרחבת הדנדריטים במהלך ההקלטה (אופציונלי).
- הכינו מראש תמיסת אלקטרודות של 100 מ"ל לרישומים מחוברים לתאים (טבלה 4). במקרה זה, הפתרון הפנימי הוא פתרון High-K+ שנועד לבודד את זרם הקטיון המופעל על ידי היפרפולריזציה מקרוסקופית (Ih) ומכיל חוסמים לתעלות היונים המגודרות במתח.
- אחסן פתרונות תוך תאיים ב- Aliquots של 2 מ"ל ב- -20 °C. השתמש ב- aliquot חדש עבור כל הפעלת הקלטה חדשה. בדוק היטב את האוסמולריות של כל אליקוט מופשר בעזרת אוסמומטר. קח aliquot חדש אם האוסמולריות אינה תואמת את הערך ההתחלתי.
- להעביר את הפתרון מן aliquot לתוך מזרק 3 מ"ל על גביו מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר ממוקם. שמור את המזרק על קרח במהלך ההקלטה כדי להגביל את השפלת התרכובות שלה (ATP, GTP או phosphocreatine).
2. ייצור ומילוי פיפטת טלאי
- מושך
- השתמש במושך אלקטרודות אופקי ובצינורות זכוכית בורוסיליקט עבים. עבור הקלטות של תאים שלמים ותאים המחוברים לתא, השתמש בקוטר חיצוני של 2 מ"מ/קוטר פנימי של 1 מ"מ. ודא כי צינורות הזכוכית נקיים לחלוטין.
- אם זה לא המקרה, לטבול נימי זכוכית בממס אורגני (למשל, אתנול) תחילה ולאחר מכן במים מזוקקים כפול. מחממים בקצרה קצוות נימים עם מבער בונזן. לחלופין, הזמינו צינורות זכוכית שטופים ומחוממים ישירות מהיצרן (ראו רשימת חומרים).
- עבור הקלטות סומטודנדריטיות כפולות, ודא שהעמידות של פיפטה סומטית היא בין 6 ל-10 MΩ ובין 8 ל-19 MΩ עבור פיפטות דנדריטיות כאשר הן מלאות בתמיסה תוך-תאית (טבלה 3). תקנן עמידות פיפטה עבור הקלטות המחוברות לתאים להתנגדות של 10 MΩ כדי להשיג תוצאות דומות לאורך התחום הסומטודנדריטי של תא העצב.
- הכינו פיפטות טריות לפני כל הקלטה (כל יום) או מיד לפני התיקון והשתמשו בהן 5 - 8 שעות לאחר ייצורן. אחסנו פיפטות במיכל זכוכית מכוסה כדי להגן עליהן מפני אבק וחסימת הקצה.
- ליטוש
- בדקו ולטשו בחום כל קצה פיפטה עם מיקרופורג' כדי להשיג אטמים טובים יותר עם הממברנה. לפני השימוש microforge, להמיס חתיכת זכוכית זעירה על חוט חימום פלטינה. החלף ציפוי זכוכית זה על חוט הפלטינה מדי יום לקבלת קביעות (פיטר ג'ונאס, תקשורת אישית).
הערה: פיפטות המשמשות להקלטות המחוברות לתאים ניתנות לציפוי לפני שלב ליטוש החום כדי להפחית את רעשי הרקע. ניתן להשתמש בחומר בידוד כגון שעווה דנטלית מותכת או אלסטומר סיליקון כדי לצפות את הפיפטות.
3. הכנת פרוסות מוח
- השתמשו בחולדות Wistar בריאות בגילאי 16-19 ימים. אין להשתמש בבעלי חיים לא בריאים או בבעלי חיים הסובלים מהיפותרמיה או התייבשות. לפני תחילת הכנת פרוסות לשמור על החיה במקום בטוח ושקט. הימנעו מכל בעל חיים אחר בחדר בזמן הכנת בעל חיים. תמרנו בעלי חיים בעדינות.
- יוצקים סוכרוז-ACSF לשני כוסות פוליפרופילן (PP) בנפח 400 מ"ל ומכניסים אותן למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 45 דקות. מערבבים את התמיסה לקבלת תמיסה הומוגנית של נוזל/קפוא קר כקרח ומניחים את הכוסות על קרח. ספק את תמיסת הסוכרוז-ACSF עם גז קרבוגן באמצעות נר מיקרו-פילטר (Ø 13 מ"מ) בכל PP.
- מכינים את כלי הפריסה ואת תא המילואים
- השתמש בכלי חיתוך רקמות באיכות גבוהה עם תנודות אנכיות נמוכות במיוחד כדי למזער את הנזק לשכבות הפרוסות השטחיות ככל האפשר. תקן סכין גילוח טרי ושלם על כלי הפריסה.
- השתמש בסכין גילוח חדש עבור כל פעולת חיתוך. הימנע מכיפוף סכין הגילוח. אין להסיר את הסרט השומני על פני השטח של סכין הגילוח (יוסף Bischofberger, תקשורת אישית).
- אם זמין, בדוק את הרטט האנכי באמצעות vibroprobe שסופק על ידי היצרן. לחלופין, השתמשו ב-vibroprobe בהתאמה אישית. הפחת את התנודות האנכיות של הלהב כך שיהיה קרוב ככל האפשר ל- 0 מיקרומטר.
- מכינים תא מילואים של 150 מ"ל לפרוסות. יוצקים ACSF סטנדרטי לתוך תא המילואים ומניחים אותו באמבט מים. ספק את תמיסת תא המילואים עם קרבוגן באמצעות נר מיקרו-פילטר (Ø 6 מ"מ). ודא כי בועות קרבוגן הם זעירים ככל האפשר.
הערה: בנו תא מילואים חדש כל 2-3 חודשים כדי לשמור על איכות פרוסה קבועה.
- חיתוך פרוסות
- בחדר שקט שבו הנסיין אינו מוטרד או לחוץ, ערפו את ראשו של בעל החיים במספריים לניתוח (אורך 150 מ"מ) בגובה המדולה הצווארית.
- חותכים את העור בחלק העליון של ראש החיה באף לכיוון קאודלי עם אזמל ולהסיר אותו לרוחב. חותכים את החלק העליון של הגולגולת מן הקאודל לחלק האף של הראש עם מספריים עדינים ולהסיר את שני חלקי הגולגולת לרוחב. הסר את המוח עם מרית דקה ושחרר אותו בזהירות לתוך PP המכילה סוכרוז-ACSF קר כקרח (0 - 4 ° C) שווה ערך עם carbogen.
הערה: רצף צעדים זה צריך להיעשות במהירות האפשרית, אך גם בקפדנות (<< דקה, כ-40 שניות).
- שמור את המוח בתמיסה של PP למשך ~ 2 עד 5 דקות. התאם את לחץ הקרבוגן כדי למנוע תנועות מוח. אם בועות הקרבוגן גדולות מדי, החליפו את נר המיקרו-פילטר בנר חדש.
- הניחו את המוח על צלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ שתחתיתה הפנימית מכוסה בשכבת סילגארד בעובי ~0.5 ס"מ. הכינו את צלחת הפטרי הזו מראש.
- הקיפו את המוח בסוכרוז-ACSF קר כקרח. ודא כי שלב נוזלי כלשהו של תמיסת ACSF-סוכרוז מטביע את המוח. עבור פרוסות העטרה, לחתוך את החלק הקדמי של המוח במישור העטרה עם אזמל או סכין גילוח. הסר את המוח הקטן עם חתך העטרה.
- החל דבק ציאנואקרילט על מגש הדגימה (שטח ~ 1 ס"מ2). הדביקו את גוש המוח כך שהחלק המצחי פונה לשלב החיתוך. בזהירות לטפטף סוכרוז-ACSF על גבי המוח המודבק באמצעות פתח גדול של פיפטה פסטר זכוכית ולאחר מכן לטבול לאט את תא החיתוך של כלי הפריסה. תמרנו את מגש הדגימה כך שמשטח החיתוך (כלומר, הרקמה הראשונה שפגעה בלהב) יהיה משטח הגחון של המוח.
- החל קרבוגן עם נר מיקרו-פילטר זכוכית מכופפת (Ø 6 מ"מ) על תא החיתוך (אופציונלי).
- כוונן את סכין הגילוח בזווית של ~15° תוך התייחסות למישור האופקי. חותכים פרוסות מוח קורונליות של ~ 500 מיקרומטר בכיוון הקאודלי לאף לפני ההגעה לחומר ניגרה. להקטין את העובי לחתוך 300 - 350 מיקרומטר פרוסות עבה המכיל את האזור של עניין.
- מפרידים פרוסות מגוש הרקמה בעזרת מחט זילוח דקה מאוד המחוברת למזרק במקביל לקצה סכין הגילוח. כופפו את המחט כך שתהיה זווית של 90° בין המחט למזרק. ודא שלא מופעל לחץ על סכין הגילוח בעת הסרת הפרוסה מגוש הרקמה.
- אחסון פרוסות
- מעבירים את הפרוסות בעזרת הפתח הגדול ביותר של פיפטת פסטר זכוכית (המחוברת לנורה) לתוך תא המילואים. לאחר שכל הפרוסות מועברות לחדר המילואים (כריסטוף שמידט-היבר, תקשורת אישית) להביא את הטמפרטורה של אמבט המים ל 34 °C (75 °F) במשך 0.5 - 1 שעות.
- לאחר תקופה זו כבו את אמבט המים ושמרו את הפרוסות בטמפרטורת החדר. התאימו את לחץ הקרבוגן על מנת למנוע תזוזה של הפרוסות בתא המילואים. שמרו את הפרוסות למשך 10 עד 20 דקות נוספות לפני תחילת ההקלטות.
- נקו את הציוד ואת נרות המיקרו-פילטר בזהירות אך ביסודיות עם מים מזוקקים פעמיים בסוף הליך החיתוך.
4. הקלטות סומטיות וסומטודנדריות כפולות בתאי עצב ניגרליים וביוגיטינים
- עקוב אחר התיאורים להרכבה של מערך מהדק טלאי עבור פרוסות המופיעים במדריך אקסון.
- הכנת תא הקלטה
- מניחים 1 - 2 מ"ל של מים מזוקקים כפול בתא ההקלטה. ודא שהוא אינו דולף. הניחו את תא ההקלטה על שולחן x-y המשתנה.
- הזנת ACSF סטנדרטי דרך מערכת צינורות זילוח אטומה לחמצן (polytetrafluoroethylene) לתא ההקלטה. לייצב את זרימת הזלוף בתא בקצב של 4 - 5 מ"ל min-1. שמור על אורך הצינור המחבר את הכד המכיל ACSF ואת תא ההקלטה קצר ככל האפשר (1 מ').
- בחרו פרוסת מוח מתא המילואים והעבירו אותה לתא ההקלטה באמצעות הפתח הגדול ביותר של פיפטת פסטר מזכוכית. מכסים את הפרוסה בטבעת פלטינה כדי לעגן אותה בתחתית תא ההקלטה. השתמשו בטבעת פלטינה שטוחה (Ø 1.5 ס"מ) והדביקו עליה חוטי ניילון מקבילים (מרווח >2 מ"מ).
- כוונון ומיטוב של האופטיקה
- דמיינו את הפרוסות באמצעות מיקרוסקופ וידאו אינפרא-אדום (IR). כוונן את תאורת קוהלר 51 ומטב אופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) או את התאורה האלכסונית (ניגודיות Dodt Gradient - DGC).
- בדקו את איכות הפרוסה. שמרו רק על פרוסות עם משטחים חלקים ואחידים שאינם בעלי ניגודיות חזקה מדי ויש להם רק מכתשים קטנים ומפוזרים.
- מלאו 2 פיפטות טלאי טריות שאינן בשימוש בתמיסה תוך-תאית (טבלה 3). השתמש בצינור 0.5 מ"ל המכיל את תמיסת פיפטה כדי למלא את קצה הפיפטה על ידי פעולת נימיות. כדי להאיץ את מילוי קצה פיפטות ללא נימה, להחיל לחץ שלילי על קצה פיפטה באמצעות צינורות מחובר מזרק.
- מקמים את הפיפטות מעל פני השטח של הפרוסה
- בדוק את נוכחותו של ציפוי כלוריד על חוטי הכסף.
- הכנס את הפיפטות ברצף למחזיקי הפיפט והפעל לחץ חיובי (~ 70 mbar) באמצעות מעגל צינורות המחבר את מחזיק הפיפטה, ברז תלת כיווני ומנומטר. הורידו את הפיפטה לאמבטיה של תא ההקלטה.
- בדוק שערך הלחץ על המנומטר קבוע עבור ~ 1 - 2 דקות. אם הלחץ יורד, בדקו את הצינורית או את טבעות האיטום בתוך מחזיק הפיפטה.
- הנח את קצה פיפטה במרכז צג הווידאו וודא שהוא אינו חסום. ודא כי קצה פיפטה אינו זז בעת הפעלת או שחרור לחץ על פיפטה.
- בדוק סחף ותנודות של קצה פיפטה על ידי ציור צלב קטן במרכז הצג בדיוק במיקום של קצה פיפטה ולהתבונן במשך 5 דקות תנועות אפשריות של הקצה.
- החל שלב מתח (5 mV) כדי לפקח על התנגדות פיפטה על אוסצילוסקופ. הגדר את פוטנציאל האחיזה של מגבר מהדק התיקון ל- 0 mV. בטל את פוטנציאל הקיזוז של פיפטה כך שזרם פיפטת DC יקרא אפס במד המגבר.
- מורידים את הפיפטות לפרוסה ושומרים אותן מעל פני השטח.
- בחר ותקן תא עצב עם דנדריטים ארוכים
- בתוך החומר השחור בחרו תא עצב בריא עם דנדריטים ארוכים שניתן לעקוב אחריהם למרחק רב בערך באותו מישור (איור 1A ו-1B) באמצעות IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). בחר גוף תא חלק והומוגני. הימנעו משני התאים בעלי הניגוד החזק בפני השטח של הפרוסה (איור 1C ו-1D), מאחר שקשה לפרוץ פנימה ולשמור על תנאי הקלטה יציבים לאורך זמן (עמידות יציבה לסדרה). בחר תאי עצב שיש להם סומא שלהם 10 - 30 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה.
- הזיזו את האלקטרודה הסומטית קרוב לסומה (במרחק של 40 - 50 מיקרומטר) ואת האלקטרודה הדנדריטית קרוב לדנדריט באותו מרחק. השתמש בהגדלה פי 2 (מחליף פי ארבעה) כדי לבחור ולתקן חלק מדנדריט. קבל על הצג הגדלה מוחלטת של 2,100X ללא הגדלה (1X) ושל 5,500X עם הגדלה פי 2.
- מעט לשחרר את הלחץ של פיפטה סומטית על ידי 10 mbar. במידת הצורך, לווסת את לחץ פיפטה דנדריטי וסומטי כדי למנוע תזוזה של מבנה התא (סומא ודנדריט) בתוך הפרוסה.
- מקמו את הפיפטה הדנדריטית קרוב לממברנה על מנת לראות פצעון קטן. שחררו את הלחץ על קצה הפיפטה והדביקו את הדנדריט תוך שליטה בהתנגדות הפיפטה. בתנאים אידיאליים, רק יניקה קלה מאוד מספיקה כדי להשיג אטימה טובה.
- הפחת את המשרעת של מעברי הקיבול פיפטה ככל האפשר על גבי מדרגת הזרם באמצעות פולס מתח עם רווח גבוה וסינון קטן 51 והאוסצילוסקופ. היכנס למצב התא כולו עם פיפטה דנדריטית.