ניתוח הפעילות העצבית בתאי עצב ראשוניים של גנגליון ספירלי מורין באמצעות מערכים מרובי אלקטרודות

תקציר

מקור: Hahnewald, S., et al. Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים הקלטה של פעילות עצבית ספונטנית ותלויית גירוי מתרביות נוירון גנגליון ספירלי ראשוני (SGN) במערך מרובה אלקטרודות (MEA). זה כרוך בשטיפה והכנה של MEA, רישום פעילות עצבית ספונטנית, והפעלת גירויים חשמליים מבוקרים כדי לזהות פעילות עצבית תלוית גירוי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. רישומים אלקטרופיזיולוגיים לחקר פעילות ספונטנית ותלויית גירוי אלקטרודות

1. שטפו את תרבית המערך הרב-אלקטרודי (MEA) בתמיסה חוץ-תאית, בטמפרטורת החדר (RT).
2. יבש את המגעים עם רקמה והרכיב את MEA על הגדרת MEA.
   הערה: כדי לשמור על התרבות לחה במהלך ההרכבה, הוסיפו טיפה קטנה של תמיסה חוץ-תאית לתרבית.
3. הוסף 300 μl של תמיסה חוץ-תאית והמתן 10 דקות לפני ההקלטה, כדי לאפשר למערכת להתייצב.
4. הקלט פעילות ספונטנית במשך 2 דקות מכל האלקטרודות על ידי לחיצה על כפתור הקלט/רכישה של התוכנה וזהה אלקטרודות הקלטה.
5. גירוי אלקטרודות MEA: בחר את המשרעת/משך/צורה של הגירוי בתוכנה המתאימה והחל אותו על מספר אלקטרודות ברצף. בחר את האלקטרודות בהתבסס על אלה המציגות פעילות ספונטנית (כמו בשלב 1.4). הקלט מכל האלקטרודות הנותרות.
6. כדי למנוע גירוי artifact, לעורר מאותה אלקטרודה 10 פעמים. אם התרבית מגיבה לפחות 8 מתוך 10 פעמים, ניתן להניח שזו תגובה חיובית על גירוי המושרה על ידי אלקטרודה.
7. כדי לזהות רעשי רקע, יש למרוח טטרודוטוקסין (TTX) על התרבית בריכוז של 1 מיקרומטר, לחסום תעלות נתרן מגודרות מתח ולהקליט במשך 2 דקות. השתמש באפשרות זו כדי לבצע זיהוי ספייקים (2.1 ו-2.2).

2. ניתוח נתונים

1. באמצעות התוכנה המתאימה לזהות פעילות ספונטנית עבור כל אלקטרודה המפעילה גלאי המבוסס על סטיות תקן ומבחין עוקב. הפעילות מופיעה כמעברי מתח מהיר (<5 מילישנייה).
2. בחר סף שאינו גורם להיעדר פעילות בעת ניתוח הדגימות שטופלו ב- TTX. התאם את ערך הסף עבור כל ניסוי כדי להבחין בין זיהוי חיובי כוזב לזיהוי שלילי כוזב.
3. באמצעות תוכנה מתאימה, התבוננו בפעילות העצבית שזוהתה של כל אלקטרודה כתרשים רסטר בהתאם לנהלים סטנדרטיים (ראו איור 1A-C).
4. קבע והצג את פעילות הרשת הכוללת על-ידי סיכום כל האירועים שזוהו בחלון הזזה של 10 אלפיות השנייה, המועבר בשלבים של 1 msec.
5. זהה פעילות הנגרמת על ידי גירוי על-ידי הצגת הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת ניתוח מתאימה. זהה את הקוצים הבודדים במצב לא מקוון באופן ידני. קוצים בודדים מופיעים כמעברי מתח מהירים, המתרחשים לאחר חפץ הגירוי (ראש חץ באיור 1E). דוגמה לכך מוצגת באיור 1E.
6. בהתאם לניסוי, נתח את מספר האלקטרודות המגיבות, הסף הדרוש להשגת תגובה, מספר פוטנציאל הפעולה לכל אלקטרודות ופרמטרים מעניינים אחרים.

תוצאות

איור 1. הקלטות נתונים ב-MEA. (A) עקבות של הקלטות מקוריות של שש מתוך 63 אלקטרודות המראות פעילות ספונטנית. (B) תרשים רסטר של שש האלקטרודות באיור 1A לאחר זיהוי ספייק. כל סרגל מייצג פוטנציאל פעולה אחד. (C) תרשים רסטר הכולל את כל האלקטרודות (כמו ב-A ו-B) הפעילות נרשמת מ-63 אלקטרודות (תעלות מספר 0-63) במשך...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסה חוץ-תאית (pH 7.4)
NaCl			145 מ"מ
KCl			4 מ"מ
MgCl2			1 מ"מ
CaCl2			2 מ"מ
HEPES			5 מ"מ
נא-פירובט			2 מ"מ
גלוקוז			5 מ"מ
חומרים
אלקטרודות MEA	Qwane Biosciences		(לוזאן, שוויץ)
תוכנה
לאבוויו	מכשירים לאומיים		שוויץ
איגורפרו	WaveMetrics		לייק אוסווגה, ארצות הברית