כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
הערה: כל משתתף המעורב בהליך צריך להיות מאומן כראוי בהליכים כירורגיים בסיסיים וחייב להיות בעל רישיון תקף לביצוע ניסויים בבעלי חיים.
1. הרדמה וטרום תרופות
- הרדימו חולדה בזריקות תוך-פריטוניאליות של נתרן פנטוברביטל (מינון התחלתי של 60 מ"ג·ק"ג-1 לחולדות וויסטאר זכרים בני 6 חודשים במשקל 400\u2012550g).
הערה: פרוטוקול זה אינו מוגבל לזן, מין או גיל החולדות שצוינו. כמו כן, ניתן להשתמש בהרדמה חלופית, כגון תערובת קטמין-קסילזין, אלפא-כלורלוז, או פנטניל+מידזולם+מדטומידין, אם מתאים יותר למטרות מחקר שונות או כאשר נדרש על ידי ועדת האתיקה.
- לאחר כ-5 דקות, בדקו את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן הגפה האחורית של החולדה במלקחיים קהים. המשך בשלבים הבאים של הפרוטוקול רק כאשר לא נצפתה פעולת רפלקס.
- להזריק 0.05 מ"ל של אטרופין תת עורית על מנת להפחית את ייצור הריר לאחר אינטובציה.
- הזריקו תת עורית 5 מ"ל של חיץ פוספט המכיל 4% תמיסת גלוקוז, NaHCO3 (1%) וג'לטין (14%). חיץ זה ייספג בכלי הדם העוריים במהלך הניסוי ויסייע בשמירה על מאזן הנוזלים.
- במהלך הניתוח, לבדוק מעת לעת את בעל החיים עבור פעולות רפלקס ולהשלים הרדמה במידת הצורך (10 מ"ג ·kg-1· h-1 של נתרן pentobarbital).
2. ניתוח
- הכינו את בעל החיים לטיפול כירורגי על ידי גילוח פרווה מעל החלק הגבי של הגפה האחורית השמאלית, מהקרסול ועד הירך, הישבן, מהזנב ועד למקטעי בית החזה הגבוהים (Th), הצד השמאלי של החזה והצד הגחוני של אזור הצוואר מעל עצם החזה
- מיקום הקו תוך ורידי
- הניחו את החולדה על גבה על כרית חימום בלולאה סגורה (ואבטחו אותה באמצעות קיבוע גפיים).
- באמצעות 21 להבים, לבצע חתך אורכי דרך העור מן עצם החזה אל הסנטר.
- החזיקו את העור במלקחיים והפרידו אותו מהרקמה שמתחתיו.
- באמצעות טכניקות דיסקציה קהה, לחשוף את הווריד הצווארי הימני. בזהירות לנתח את הווריד מן הרקמות שמסביב.
- אתר את החלק של הווריד ללא נקודות הסתעפות והחליק שתי ליגטורות 4-0 מתחתיו.
- צור קשר רופף אחד בקצה הפרוקסימלי של המקטע הלא מסתעף שזוהה קודם לכן של הווריד וקשר רופף אחד בקצה הדיסטלי של קטע זה של הווריד. מהדק את הווריד פרוקסימלי ללב, ולאחר מכן ligate את החלק הדיסטלי של הווריד.
- באמצעות מספריים הקשתית, לעשות חתך בין מהדק ליגטורה רחוק. החזיקו דש של הווריד והכניסו קטטר מלא מראש עד לנקודה שבה הוא חסום על ידי המהדק.
- תוך כדי החזקת הווריד והצנתר יחד עם מלקחיים, הסירו את המהדק ודחפו את הצנתר מספר מילימטרים לתוך הווריד. הצמידו את שני קצוות הצנתר לווריד והוסיפו נקודת קיבוע נוספת לעור.
3. הכנסת צינור קנה הנשימה
- באמצעות מלקחיים קהים, להפריד את שתי בלוטות mandibular מכסה את השרירים sternohyoids. להפריד שרירים sternohyoid בקו האמצע כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- החליקו שלוש ליגטורות 4-0 מתחת לקנה הנשימה, ואז בצעו שני קשרים מתחת לנקודת החדרת צינור קנה הנשימה וקשר אחד מעל.
- אתר את הסחוס הקריקואידי של הגרון ובצע חתך מתחת לסחוס קנה הנשימה השלישי.
- הכנס צינור קנה נשימה במורד קנה הנשימה וחבר את הצינור למקומו באמצעות ליגטורות מוכנות מראש, ולאחר מכן הוסף רצועה נוספת לעור.
- מניחים חתיכה קטנה של צמר גפן מעל השרירים המופרדים ותופרים את העור מעל האזור המנותח.
4. דיסקציה של עצבי הגפיים האחוריות
- באמצעות להב 21 מבצעים חתך אורכי בצד האחורי של הגפה האחורית השמאלית, מגיד אכילס ועד הירך.
- תפסו את העור במלקחיים, ובעזרת טכניקות דיסקציה קהה, הפרידו את העור מהשרירים שמתחתיו משני צידי החתך.
- אתר את הפוסה הפופליטלית בחלק האחורי של מפרק הברך, אשר מכוסה על ידי שריר הירך הדו-ראשי, ובאמצעות מספריים, בצע חתך בין החלק הקדמי והאחורי של שריר זה.
- נעים כלפי מעלה, חותכים שני ראשים של שריר הירך עד הירך כדי לחשוף את העצב הסיאטי. צרוב לפי הצורך כדי למנוע דימום.
- זהה את הענפים הסוראליים, הטיביאליים והנפוצים של העצב הסיאטי.
- באמצעות מספריים, להפריד את לרוחב מן הראש המדיאלי של שריר gastrocnemius לחשוף את העצב tibial ואת ענפיו.
- בעזרת 55 מלקחיים, תופסים את הקצה הדיסטלי של העצב הסורי, חותכים אותו בצורה דיסטלית, ומנתחים אותו רחוק ככל האפשר.
- חזור על ההליך עם העצב הפרוניאלי המשותף.
- באמצעות מוט זכוכית קהה מפרידים את העצב הטיביאלי מהרקמות הסובבות אותו, מקפידים שלא לפגוע בכלי הדם, וחותכים אותו בצורה דיסטלית.
- זהה את הגסטרוקנמיוס המדיאלי (MG) ואת עצבי הגסטרוקנמיוס והסוליאוס הצדדיים (LGS).
- באמצעות 55 מלקחיים, לנתח בזהירות את עצבי MG ו- LGS, לנתק אותם מהרקמות שמסביב אך לשמור על הקשר שלהם לשרירים בהתאמה.
- הניחו פיסת צמר גפן ספוגה במי מלח מתחת לעצבים החשופים.
- יש לסגור את העור מעל האזור המנותח.
5. למינקטומיה
- באמצעות להב 21, לבצע חתך אורכי מן העצה עד חוליות החזה.
- יש להפריד את העור מהשרירים שמתחתיו.
- חתכו את שריר הלונגיסימוס משני צידי תהליכי עמוד השדרה החזי והמותני.
- באמצעות אזמל קהה, משכו את השרירים מעמוד השדרה כדי לחשוף את התהליכים הרוחביים של כל חוליה.
- בעזרת מספריים קהות חותכים את גידי השרירים המחוברים לתהליכים הרוחביים לאורך עמוד השדרה החשוף. החל חומרים המוסטטיים במידת הצורך.
- זהה את חוליית Th13 כמקטע בית החזה הנמוך ביותר עם החדרת צלעות, ובאמצעות רונג'ורים עדינים הסר תהליכים בעמוד השדרה ואת הלמינה מחוליות Th13 עד L2 כדי לחשוף מקטעים מותניים של חוט השדרה. זכור לא לפגוע בתהליך עמוד השדרה L3, אשר ישמש כנקודת קיבוע לייצוב עמוד השדרה.
- הסר את התהליך הספינוסי Th12 והחליק את פני החוליה הגביים ככל האפשר.
- באמצעות טכניקות דיסקציה קהה, להפריד את השרירים מחוליית Th11 כדי ליצור נקודות החדרה המחזיק.
- הניחו צמר גפן דק וספוג במי מלח על מקטעי חוט השדרה החשופים.
- העבירו את החולדה למסגרת המתכת בהתאמה אישית עם שני מוטות מקבילים ושתי זרועות מתכווננות עם מלחציים לתמיכה ולייצוב עמוד השדרה.
6. הכנה להקלטה ולגירוי
- קיבוע עמוד השדרה וסידור העצבים
- הניחו את החולדה במסגרת בהתאמה אישית על כרית חימום המחוברת למערכת החימום בלולאה סגורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37 ± 1 מעלות צלזיוס.
- הכנס אלקטרודות אלקטרוקרדיוגרמה (אק"ג) מתחת לעור וחבר למגבר לניטור דופק.
- באמצעות דשי העור, יוצרים בריכה עמוקה מעל חוט השדרה החשוף.
- באמצעות מלחציים מתכתיים, תקן את עמוד השדרה על ידי הצבת מלחציים מתחת לתהליכים הרוחביים Th12 ובתהליך עמוד השדרה L3.
- ודא כי עמוד השדרה מאובטח ומסודר אופקית, ולאחר מכן להפעיל לחץ דורסו-גחוני משני צידי העמוד כדי למשוך את השרירים.
- מלאו את הבריכה בשמן מינרלי חם (37 מעלות צלזיוס) ושמרו עליה בטמפרטורה זו.
- להשחיל רצועה 4-0 דרך גיד אכילס, להרים ולמתוח את הגפה האחורית השמאלית המנותחת כך שהקרסול מפולס עם הירך.
- בעזרת דשי העור, צרו בריכה עמוקה מעל העצבים החשופים, הטיביאליים, MG ו-LGS.
- מלאו את הבריכה בשמן מינרלי חם (37°C).
- הניחו את עצבי MG ו-LGS על אלקטרודות מעוררות חוטי כסף דו-קוטביים וחברו אותם לממריץ דופק מרובע. השתמש בערוצי גירוי נפרדים לכל עצב.
7. מיקום אלקטרודות משטח
- הניחו אלקטרודה כדורית כסופה בצד הקאודלי השמאלי של חוט השדרה החשוף, עם אלקטרודת ייחוס המוחדרת לשרירי הגב, וחברו את שתי האלקטרודות למגבר DC הדיפרנציאלי. אלקטרודת כדור פני השטח תשמש לרישום מטחים מרגשים מעצבים.
- באמצעות מגרה זרם קבוע, לעורר את העצבים MG ו- LGS עם פולסים מרובעים של 0.1 ms משך, חזר על עצמו בתדר של 3 הרץ, ולצפות מטחים afferent.
- קבע את הסף (T) להפעלת עצבים, עורר כל עצב בעוצמה של כ- 3·T, ורשום את המשרעת של מטח ה- afferent עבור כל עצב.
- הזז את רוסטרל אלקטרודת פני השטח וחזור על ההליך כדי לזהות מקטעי עמוד שדרה שבהם המשרעת של המטחים היא הגבוהה ביותר עבור כל עצב. לאחר קביעת מיקום המטח המרבי, הזז את אלקטרודת פני השטח למרחק בטוח מחוט השדרה.
- שיתוק שרירים ויצירת דלקת ריאות על מנת להפחית את תנועות הנשימה
- יש לשתק את החולדה תוך ורידי באמצעות חוסם עצבי-שרירי ולחבר את צינור קנה הנשימה למכונת הנשמה חיצונית בקו אחד עם קפנומטר תואם מכרסמים (פנקורוניום ברומיד, במינון התחלתי של 0.4 מ"ג·ק"ג-1, בתוספת כל 30 דקות במינונים של 0.2 מ"ג·ק"ג-1)
- נטרו את ריכוז ה-CO2 הסופי ושמרו עליו על כ-30124% על ידי התאמת פרמטרי אוורור (תדר, לחץ אוויר ונפחי זרימה).
- בצע חתך אורכי בעור בין הצלע החמישית והשישית בצד ההקלטה.
- באמצעות מספריים קצה קהה, לחתוך את השרירים מעל כדי לדמיין את החלל intercostal בין הצלעות.
- באמצעות מספריים קטנים וחדים, לבצע חתך קטן בשרירים intercostal ואת הצדר, ולאחר מכן להכניס את קצה של מלקחיים קהה לתוך הפתח, נזהר לא ללחוץ על הריאות.
- אפשר למלקחיים להתרחב או להחדיר צינור קטן כדי לשמור על דלקת ריאות פתוחה לאורך כל הניסוי.
- לאחר החסימה העצבית-שרירית, יש לעקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת תדירות האק"ג ולהשלים את חומר ההרדמה אם קצב הלב עולה על 400 פעימות לדקה. שיתוק שרירים ויצירת דלקת ריאות להפחתת תנועות נשימה אשר ישפרו את יציבות הרישום.
8. פתיחת הדורה והפיה מאטר
- באמצעות #55 מלקחיים, להרים בעדינות את dura mater לחתוך אותו caudally מן קטע L5, rostrally עד קטע L4.
- באמצעות זוג מלקחיים 5SF דקים במיוחד, לעשות טלאי קטן pia מכסה את העמוד הגבי בין כלי הדם, בדיוק ברמה של מטח afferent מקסימלית מן MG או עצב LGS.
- השתמשו בחתיכות קטנות של קצף ג'ל מיובש וספוג במי מלח כדי לחסום דימום במידת הצורך.
9. מיקום אלקטרודות לגירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה (tsDCS)
- בצע חתך קטן בעור בצד הגחוני של בטנה של חולדה ברמה הרוסטרוקאודלית המתאימה למיקום מקטעי עמוד השדרה המותניים (L)4-L5.
- תפוס את דש העור החשוף עם אטב מתכת, שישמש כאלקטרודת ייחוס.
- מניחים ספוג ספוג במי מלח בצד הגבי של חוליית בית החזה (Th) 12. ודא שגודל הספוג שווה לזה של אלקטרודת tsDCS פעילה (לוח נירוסטה בצורת עיגול בקוטר 5 מ"מ).
- באמצעות מניפולטור עדין, לחץ את הספוג עם אלקטרודת tsDCS פעילה אל העצם וודא שכל פני השטח של האלקטרודה נלחצים באופן שווה.
- חבר אלקטרודות ייחוס ואלקטרודות tsDCS פעילות ליחידת גירוי זרם קבוע המסוגלת לספק זרימה רציפה של זרם ישיר.
10. הכנת מיקרופיפטות
- באמצעות מושך מיקרואלקטרודות, להכין microelectrode.
הערה: ניתן להשתמש הן באלקטרודות נימה והן באלקטרודות שאינן נימה. עם זאת, זכור כי השוק של האלקטרודה חייב להיות ארוך מספיק כדי להגיע לקרן הגחון תוך שהוא דק מספיק כדי לא לדחוס את חוט השדרה בזמן הירידה.
- כוונן את הגדרת המושך כך שהשוק הנכנס לחוט השדרה יהיה באורך של כ-3 מ"מ, בעוד שקצה האלקטרודה יהיה בקוטר של לא יותר מ-1\u20122 מיקרומטר, והתנגדות המיקרואלקטרודות תהיה בין 10 ל-20 MΩ.
- מלאו את המיקרואלקטרודות באלקטרוליט אשלגן-ציטראט 2M.
- הרכיבו את המיקרואלקטרודה המוכנה על המיקרומניפולטור, ואפשרו תנועת צעד של 1\u20122 מיקרומטר וכיול סטריאוטקסי.
- חבר את המיקרואלקטרודה למגבר התוך תאי באמצעות אלקטרודת הייחוס הממוקמת בשרירי הגב.
- לאחר החסימה העצבית-שרירית, יש לעקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת תדירות האק"ג ולהשלים את חומר ההרדמה כך שקצב הלב של החולדה לא יעלה על 400 פעימות לדקה.
11. מעקב אחר מוטונורון וחדירה
- הניחו את אלקטרודת הקלטת המטח האפרנטי בחזרה על פני השטח הגבי של חוט השדרה, באופן קאודלי למיקום אתר ההקלטה, ברמה של קטע L6.
- לעורר את הגסטרוקנמיוס המדיאלי (MG) ואת עצבי הגסטרוקנמיוס והסוליאוס הלטרליים (LGS) עם פולסים חשמליים של 0.1 מילישניות בתדר של 3 הרץ ועוצמה של 3T כדי להפעיל את כל האקסונים של אלפא-מוטונוירונים בתוך עצב נבחר.
- הניעו את המיקרופיפטה לתוך מדבקה נבחרת ב-PIA עם זווית בינונית של 15\u201220° (עם קצה מכוון לרוחב).
- לאחר הירידה מתחת לפני השטח, לכייל את המיקרואלקטרודה ולפצות על הקיבול והיסט המתח שלה, ולהמשיך בחדירה של חוט השדרה כאשר כל הפרמטרים יציבים. פוטנציאל שדה אנטידרומי של מאגר המוטונוירונים ייראה בעקבות מתח המיקרואלקטרודות תוך כדי התקרבות לגרעין מוטורי ייעודי במהלך גירוי של העצב המתאים.
- המשך בחדירה עם המיקרואלקטרודה בצעדים של 1\u20122 מיקרומטר והשתמש מעת לעת בפונקציית הזמזום של המגבר התוך תאי כדי לנקות את קצה האלקטרודה מכל שאריות.
- שימו לב לחדירת מוטונורון, אשר תאופיין בהיפרפולריזציה פתאומית של עקבות המתח שנרשמו והופעת פוטנציאל ספייק אנטידרומי.
12. רישום קרום מוטונורון ותכונות ירי
- במצב גשר של המגבר התוך-תאי, זהה את המוטונוירון בהתבסס על המראה "הכל או כלום" של פוטנציאל הפעולה האנטידרומי על ידי גירוי ענפי העצבים המתאימים. רשום 20 עקבות עוקבות לממוצע מאוחר יותר.
- יישם קריטריון הכללה קפדני כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה: פוטנציאל קרום מנוחה של לפחות -50 mV באמפליטודה; אמפליטודות פוטנציאל פעולה גדולות מ -50 mV, עם overshoot חיובי; פוטנציאל הממברנה יציב לפחות 5 דקות לפני ההקלטה.
- במצב מהדק זרם לא רציף (מצב קצב מתג זרם 4-8 קילוהרץ) של המגבר התוך-תאי, עורר פוטנציאל פעולה אורתודרומי במוטונורון באמצעות פולסי זרם דה-פולריזציה תוך-תאיים של 0.5 אלפיות השנייה. חזור על הפעולה לפחות 20 פעמים עבור ממוצע לא מקוון.
- לעורר motoneuron עם 40 פולסים קצרים (100 ms) של זרם hyperpolarizing (1 nA) על מנת לחשב התנגדות קלט התא.
- לעורר מוטונורון עם פעימות גל ריבועיות של 50 מילישניות באמפליטודות הולכות וגדלות כדי לקבוע את ערך בסיס הריאו כמשרעת המינימלית של זרם דה-פולריזציה הנדרש כדי לעורר ספייק יחיד.
- הזריקו פולסים של 500 מילישניות של גל מרובע של זרם דה-פולריזציה, באמפליטודות הולכות וגדלות בצעדים של 0.1-2 nA כדי לעורר פריקות קצובות של מוטונוירונים.
13. גירוי זרם ישיר חוצה עמוד השדרה (tsDCS)
- תוך שמירה על חדירה יציבה של motoneuron, להתחיל את הליך הקיטוב על ידי יישום trans-spinal של זרם ישיר. התאם את העוצמה הנוכחית ואת זמן היישום לתכנון הניסוי (לדוגמה, 0.1 mA למשך 15 דקות).
- מיד לאחר הפעלת DC, שימו לב לפוטנציאל קרום המוטונוירון. קיטוב אנודלי (האלקטרודה הפעילה כאנודה) אמור לגרום לדפולריזציה של פוטנציאל הממברנה, בעוד שקיטוב קתודאלי (האלקטרודה הפעילה כקתודה) אמור לעורר אפקט הפוך. שימו לב אם שינוי בפוטנציאל קרום המנוחה בתגובה לגירוי DC הוא קבוע, מה שמבטיח שעוצמת השדה החשמלי לא תושפע.
- במהלך יישום זרם רציף, חזור על שלבים 5.3\u20125.6 במרווחים של 5 דקות.
- כבה את ה-DC והמשך לחזור על שלבים 5.3\u20125.6 במרווחי זמן של 5 דקות עד שההקלטות הופכות לבלתי יציבות או עד שקריטריוני ההכללה נפגעים.
- לסיים את הניסוי ולהרדים את החיה באמצעות מתן תוך ורידי של מנה קטלנית של נתרן pentobarbital (180 מ"ג·kg-1).
awy Sp. z o.o