הפעלת זרמי רעש על נוירונים של גרעין שיווי המשקל המדיאלי באמצעות טכניקת מהדק טלאי של כל התא

תקציר

מקור: Stefani, S. P., et al. יישום רעש סטוכסטי להערכת רגישות נוירון גרעין שיווי משקל מדיאלי במבחנה. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים פרוטוקול הכולל יישום של זרמי רעש תת-סף על נוירונים של גרעין שיווי המשקל האמצעי, תוך שימוש בטכניקת מהדק-טלאי של התא כולו כדי לחקור את ההשפעה של זרמי הרעש על רגישות עצבית לגירויים חשמליים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בעלי חיים

הערה: עכברים התקבלו ממרכז המכרסמים האוסטרלי (ARC; פרת', אוסטרליה) ונערך במתקן לבעלי חיים בבניין הקרן הרפואית באוניברסיטת סידני.

1. שמרו על העכברים במחזור אור/חושך סטנדרטי של 12 שעות עם העשרה סביבתית.
2. השתמש בעכברי C57BL/6 זכרים ונקבות (בני 3-5 שבועות) לכל הניסויים.

2. הכנת פתרונות

1. הכן 1 ליטר של נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) המורכב מ 29 mM NaHCO₃, 11 mM גלוקוז, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO₄, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl₂.
2. הכן 200 מ"ל סוכרוז-ACSF (sACSF) המכיל 29 mM NaHCO₃, 11 mM גלוקוז, 241.5 mM סוכרוז, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO₄, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl₂. לפני הוספת CaCl₂ ל-ACSF ול-sACSF, יש לגזים את התמיסות בקרבוגן (95% O₂ ו-5% CO₂) כדי ליצור pH של 7.4 ולהימנע ממשקעים של סידן (עננות).
3. הכן תמיסה תוך-תאית מבוססת K⁺ המורכבת מאשלגן גלוקונאט 70 mM, KCl 70 mM, NaCl 2 mM, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg 2-ATP, 0.3 mM Na_3-GTP, עם pH סופי של 7.3 (מותאם באמצעות KOH).
   הערה: מומלץ לסנן פתרונות תוך תאיים עם מסנני 0.22 מיקרומטר ולאחסן באליציטוטים של 0.5 מ"ל ב -20 מעלות צלזיוס.

3. הכנת גזע המוח

1. לפני מיצוי גזע המוח, אזנו את ה-sACSF עם קרבוגן וקררו בטמפרטורה של -80°C למשך 25 דקות ליצירת תרחיף קרח.
2. מרדימים את העכבר עם איזופלורן (3-5%) רווי בחמצן (3 מ"ל/דקה). ברגע שרפלקסי הכפות האחוריות נעדרים, ערפו את ראשו של העכבר עם מספריים חדים מפלדת אל-חלד.
3. חשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך sagittal בעור באמצעות סכין גילוח (#22 מעוגל).
4. בעזרת הקצה המחודד של זוג מספריים סטנדרטיים, מבצעים חתך קטן בלמדא וחותכים לאורך הסדק האורכי.
5. שיקפו בזהירות את העצמות הקודקודיות והעורפיות באמצעות זוג רונגיורים של פירסון רדודים ומכופפים.
   הערה: המוח נשטף ברציפות באתרו באמצעות תרחיף sACSF קר כקרח שהוכן בעבר במהלך הליך זה.
6. בודדו את גזע המוח מהמוח הקדמי ומהמעטפת הגרמית שלו באמצעות סכין גילוח (#11 ישר) כדי לחתוך את החריץ הקודקוד-עורפי ובמדולה הקאודלית.
7. הרכיבו את הקצה הגחוני המבודד של גזע המוח על בלוק פוליסטירן טרפזי שנחתך בעבר. השתמש בפתיל נייר טישו כדי להסיר נוזלים עודפים סביב הרקמה המנותחת ולהבטיח היצמדות טובה של הרקמה לשלב החיתוך.
   הערה: בלוק הפוליסטירן נחתך בצורת טרפז כדי להבטיח שהקצה הרוסטרלי של המוח התיכון יתאים ויתחבר לחוט השדרה.
8. השתמש בדבק ציאנואקרילט כדי לקבע את בלוק הפוליסטירן עם קצה רוסטרל גזע המוח המחובר עד לשלב החיתוך.
9. באמצעות מהירות מתקדמת של 0.16 מ"מ לשנייה ומשרעת רטט של 3.00 מ"מ, הכינו פרוסות רוחביות של 200 מיקרומטר של MVN.
   הערה: מיקומו של ה-MVN נקבע באמצעות אטלס המוח של עכברי פקסינוס ופרנקלין. ה-MVN (הרשום כ-MVe באטלס) נמצא מיד גחוני לחדר ה-4 והוא הגדול ביותר ממש לפני החיבור של המוח הקטן (בין הקוליקולי התחתון לאובקס).
10. השתמש פיפטה גזוז פלסטיק כדי להעביר פרוסות על דיסק נייר מסנן יושב ACSF carbogenated ב 25 ° C לפחות 30 דקות לפני ההקלטה.

4. כלי נגינה

1. השתמש במערך אלקטרופיזיולוגי סטנדרטי כדי לבצע את טכניקת הידוק המדבקה של התא כולו.
2. הכינו מיקרופיפטות באמצעות פרוטוקול דו-שלבי (שלב חימום 1: 70; שלב חימום 2: 45) על מושך מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים).
3. כאשר ממוקם באמבטיה, micropipettes צריך להיות התנגדות סופית הנע בין 3 ל 5 MΩ עם פתרון פנימי.
   הערה: ההגדרות המשמשות עשויות להשתנות בהתאם לטמפרטורה בחדר ויכולות להשתנות לעתים קרובות למדי.

5. אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם

1. כדי להשיג הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים מתאי עצב בודדים ב-MVN, נעשה שימוש בתמיסה פנימית מבוססת K+ בתוך פיפטת ההקלטה.
2. מעבירים פרוסת רקמה בודדת מתא הדגירה לתא ההקלטה ומהדקים אותה באמצעות חוט ניילון על משקולת בצורת U. יש לנקב ברציפות את תא ההקלטה עם ACSF קרבוגני ב-25°C בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה.
3. לאחר מילוי מיקרופיפטה בתמיסה פנימית, אתר את ה- MVN באמצעות עדשה אובייקטיבית בהספק נמוך (10x). באמצעות מטרה בעוצמה גבוהה (40x), תאי עצב בודדים בתוך MVN יכולים להיות ממוקמים.
   הערה: איכות התא חיונית להבטחת הקלטות איכותיות ועמידות התא בעת ניסיון להשיג את תצורת התא כולו. תא מתאים ידגים צורה כדורית, קרום תא מחזיר אור וגרעין בלתי נראה. תא לא מתאים יהיה בעל גרעין גלוי גדול (דמוי ביצה) ומראה נפוח/מכווץ.
4. לפני פריצת הרקמה עם פיפטה, להפעיל כמות קטנה של לחץ חיובי כדי לדחוף פסולת הרחק מקצה פיפטה.
5. הזז את פיפטה באמצעות מיקרומניפולטור לכיוון תא העצב שנבחר, וגומה קטנה צריכה להיווצר על הממברנה העצבית.
   שחררו לחץ חיובי והפעילו כמות קטנה של לחץ שלילי.
6. לאחר השגת אטם 1 GΩ, הפעילו לחץ שלילי עדין, קצר וחד על מחזיק פיפטה דרך פתח היניקה כדי לקרוע את הממברנה וליצור תצורה של תא שלם.
7. בצע הקלטות מהדק זרם של תא שלם באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

6. החלת רעש סינוסואידי וסטוכסטי על נוירונים בודדים של גרעין שיווי המשקל המדיאלי

1. החל את הרעש הסטוכסטי והסינוסואידלי בטווח של אמפליטודות מ 3 עד 24 pA כדי לקבוע סף עצבי וקצב ירי.
2. קבעו את הסף החושי על-ידי קיבוץ עוצמות גירוי נמוכות וגבוהות יותר ובצעו ANOVA כדי לבחון הבדלים כלשהם (כפי שמוצג באיור 1).
3. חשב את קצב הירי הממוצע במהלך 10 השניות שבהן שלב הדה-פולריזציה הנוכחי הוזרק עבור כל רמה נוכחית בודדת (כלומר, 7 פרקים בסך הכל; איור 2).
4. השתמש בערכי קצב הירי הממוצע כדי ליצור קצב ירי לעומת התרשים הנוכחי ובצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את שיפוע הקו המתאים ביותר. השיפוע של הקו המתאים ביותר מצביע על רווח עצבי.

תוצאות

תרשים 1: קביעה אובייקטיבית של סף 12 pA. שיעורי הירי של פחות מ-12 pA (3 ו-6 pA) ויותר מ-12 pA (18 ו-24 pA) אוחדו וממוצעו. ממוצעים אלה נותחו לאחר מכן באמצעות ANOVA ומובהקות סטטיסטית בין sham ו- >12 pA ובין <12 pA ל- >12 pA. *P < 0.05.

איור 2: פרופילים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CaCl2	שרלאו	CA01951000	משמש עבור ACSF ו- sACSF
D-(+)-גלוקוז	סיגמא	G8270	משמש עבור ACSF ו- sACSF
EGTA	סיגמא	E0396-25G	משמש לפתרון תוך-תאי מבוסס K
HEPES	סיגמא	H3375-25G	משמש לפתרון תוך-תאי מבוסס K
KCl	אספקת כימיה	PA054-500G	משמש עבור ACSF, sACSF ותמיסה תוך תאית
קיי-גלוקונאט	סיגמא	P1847-100G	משמש לפתרון תוך-תאי מבוסס K
MG-ATP	סיגמא	A9187-500 מ"ג	משמש לפתרון תוך-תאי מבוסס K
MgCl	אספקת כימיה	MA00360500	משמש עבור ACSF ו- sACSF
Na3-GTP	סיגמא	G8877-100MG	משמש לפתרון תוך-תאי מבוסס K
NaCl	אספקת כימיה	SO02270500	שימוש עבור ACSF ותמיסה תוך-תאית
NaH2PO4.2H 2O	אייקס	AJA471-500G	משמש עבור ACSF ו- sACSF
NaHCO3	סיגמא	S5761-1KG	משמש עבור ACSF ו- sACSF
סוכרוז	אספקת כימיה	SA030-500G	משמש עבור sACSF
איזופלורן	הנרי שיין	1169567762	משמש להרדמת עכברים
ציוד
נימי זכוכית בורוסיליקט	מכשירי וורנר	GC150T-7.5	קוטר חיצוני בגודל 1.5 מ"מ, קוטר פנימי (ID) 1.16 מ"מ, 7.5 ס"מ<בר/> אורך
תוכנה לרכישת נתונים	אקסוגרף		משמש לאלקטרופיזיולוגיה ואנליזה
פרידמן-פירסון רונג'ורס	מכשירים מדויקים בעולם	14089	משמש לדיסקציה
מושך מיקרופיפטה	נארישיגה	PP-830	משמש מיקרופיפטה
מגבר Multiclamp	מכשירי אקסון	700 ב'	משמש לאלקטרופיזיולוגיה
מד pH	ספר מדעי	860033	משמש לפתרון פנימי
מספריים עם תבנית סטנדרטית	FST	14028-10	משמש לדיסקציה
סאטר מיקרומניפולטור	סאטר	MP-225/מטר	משמש לאלקטרופיזיולוגיה
מיקרוסקופ זקוף	אולימפוס	BX51WI	משמש לאלקטרופיזיולוגיה
ויברטומה	לייקה	VT1200	משמש לחיתוך רקמת מוח