זיהוי רמות מי חמצן בתאי עצב בתרבית באמצעות הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים

תקציר

מקור: Terzi, A. et al., ROS Live Cell Imaging במהלך התפתחות עצבית.J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי רמות מי חמצן בזמן אמת בתאי גנגליון ברשתית באמצעות הביוסנסור roGFP2-Orp1 וטכניקות הדמיה של תאים חיים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהכנת תאים, דימות פלואורסצנטי וכימות רמות מי חמצן.

פרוטוקול

1. הדמיית מיני חמצן תגובתי במבחנה (ROS) של תאי עצב של תאי גנגליון רשתית בתרבית (RGC)

1. ביום ההדמיה (בדרך כלל 6-24 שעות לאחר ציפוי התא), בדוק תאי גנגליון רשתית תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסונים RGC.
2. להדמיית תאים חיים, העבירו את הכיסויים מצלחת התרבית לתא הדמיה של תאים חיים.
3. הגדר מיקרוסקופ להדמיה. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה לניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), מסנן אדום בעל מעבר ארוך OG590 ומצלמת EM-CCD.
4. לפני ההדמיה, החלף את מדיום תרבית תאי דג הזברה בסרום ואנטיביוטיקה (ZFCM)(+)) בתווך תרבית תאי דג זברה ללא סרום ואנטיביוטיקה (ZFCM(-)).
5. ברגע שהתאים ממוקמים עם מטרה של פי 10, השיגו תמונות בהגדלה של פי 60 באמצעות יעד טבילה גבוה של שמן NA. השתמש בהגדלה נוספת של פי 1.5.
6. ראשית, לרכוש תמונות DIC. לאחר מכן, תמונה roGFP2-Orp1 באמצעות ערכת מסננים מתאימה. הפעל את roGFP2-Orp1 עם מסנני עירור 405/20 ו- 480/30 ננומטר ברצף וקבל תמונות עם מסנן פליטה של 535/30 ננומטר לאחר שאור הפליטה עבר את המראה הדיכרואית 505DCXR.
7. לאחר צילום קבוצת התמונות הראשונה, החלף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש להחליף את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויים ב- pH ובאוסמולריות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית 35 מ"מ	זארשטדט	83-3900
כיסוי זכוכית	קורנינג	2850-22
כלי פטרי חד פעמיים (100 x 15 מ"מ)	VWR	25384-094
סרום בקר עוברי	תרמופישר סיינטיפיק	26140087
מיקרוסקופ הפוך	ניקון	TE2000
למינין	תרמופישר סיינטיפיק	23017-015
L-15 בינוני של לייבוביץ עם פנול אדום	גיבקו/פישר סיינטיפיק	11-415-064
L-15 בינוני של לייבוביץ' ללא פנול אדום	גיבקו/פישר סיינטיפיק	21-083-027
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122
פנול אדום	סיגמא אלדיץ'	P0290
פולי-די-ליזין (PDL)	סיגמא אלדיץ'	P7280
מסנן סטריטופ 0.22 מיקרומטר	מיליפור	S2GPT05RE
סידן כלורי דיהידראט	פישר סיינטיפיק	C79-500
גלוקוז	סיגמא אולדריץ'	G7528
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H4034